Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Summary

Cyclin-avhengige kinase 1 (Cdk1) er aktivert i G2 fase av cellen syklus og regulerer mange mobilnettet baner. Her presenterer vi en protokoll for i vitro kinase analysen med Cdk1, som gjør identifisering av Cdk1-spesifikke fosforylering områder for å etablere mobilnettet mål for denne viktige kinase.

Abstract

Cyclin-avhengige kinase 1 (Cdk1) er en mester kontroller for cellen syklusen i alle eukaryoter og phosphorylates anslagsvis 8-13% av proteom; men er antall identifiserte mål for Cdk1, spesielt i menneskeceller fortsatt lav. Identifikasjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder er viktig som de gir mekanistisk innsikt i hvordan Cdk1 styrer cellen syklus. Cellen syklus regulering er avgjørende for trofast kromosom segregering mangler i denne kompliserte prosessen fører til chromosomal avvik og kreft.

Her beskriver vi en i vitro kinase analyse som brukes til å identifisere Cdk1-spesifikke fosforylering områder. I denne analysen, en renset protein er fosforylert i vitro av kommersielt tilgjengelige menneskelige Cdk1/cyclin B. vellykket fosforylering er bekreftet av SDS side og fosforylering nettsteder identifiseres senere massespektrometri. Vi beskriver også rensing protokoller som gir svært ren og homogen protein forberedelser for kinase analysen, og en bindende analysen identifiserte fosforylering nettsteder, som sonder samspillet mellom funksjonell bekreftes et klassisk kjernefysiske lokalisering signal (cNLS) og dens kjernefysiske transport reseptoren karyopherin α. For å hjelpe med eksperimentell design, vi går gjennom metoder for prediksjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder fra protein sekvenser. Sammen gir disse protokollene en svært kraftig metode som gir Cdk1-spesifikke fosforylering områder og aktiverer mekanistisk studier i hvordan Cdk1 styrer cellen syklus. Siden denne metoden er avhengig av renset proteiner, kan den brukes på modellen organismen og gir pålitelig resultat, spesielt kombinert med cellen funksjonelle studier.

Introduction

Kinaser er enzymer som overføre fosfat grupper fra ATP på underlag og regulere mange cellulære prosesser. Denne fosforylering reversibel, rask, legger to negative kostnader, og lagrer fri energi og er en av de vanligste posttranslational modifikasjonene brukes av celler. Cdk1, som kalles også cellen divisjon syklus protein 2 homolog (cdc2) er en mester kontroller for cellen syklusen i alle eukaryoter^1,2,3,4,5, og phosphorylates en anslagsvis 8-13% av proteom^6,

Protocol

1. prediksjon av Cdk1-spesifikke fosforylering nettsteder fra Protein sekvensen

1. Før analysen kinase, analysere protein sekvens for predikerte Cdk1-spesifikke fosforylering områder og søke litteraturen for eksperimentelt etablerte fosforylering nettsteder med ukjent kinase spesifisitet. Bruk av følgende verktøy, databaser og referanser som summeres.
   1. Bruke IGPer 3.0 programvare^36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) for å forutsi Cd.......

Discussion

Våre i vitro kinase analysen er en meget kraftfull metode å identifisere molekylære mål for kinase Cdk1, som er en master kontroller av cellen syklus og regulerer mange viktige cellulære prosesser. Metoden bestemmer hvis en renset protein er et medium for Cdk1 og lar identifikasjon av bestemte fosforylering nettsteder. Dette forenkler mekanistisk studier for regulering av cellulære prosesser ved fosforylering gjennom Cdk1.

Den mest kritiske faktoren for vellykket identifikasjon .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778