Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Summary

Циклин зависимая киназа 1 (Cdk1) активируется в G2 фазе клеточного цикла и регулирует многие сотовых пути. Здесь мы представляем протокол assay киназы в пробирке с Cdk1, который позволяет идентифицировать Cdk1-конкретных фосфорилирование сайтов для создания клеточных мишеней этой важной киназы.

Abstract

Циклин зависимая киназа 1 (Cdk1) представляет собой главный контроллер для клеточного цикла в всех эукариот и фосфорилирует оценкам 8-13% протеома; Однако количество выявленных целей для Cdk1, особенно в клетках человека по-прежнему низка. Определение участков фосфорилирование Cdk1-конкретных важно, как они обеспечивают механистический понимание как Cdk1 управляет клеточного цикла. Регуляции клеточного цикла имеет решающее значение для верующих хромосома сегрегации, и дефекты в этот сложный процесс приведет к хромосомных аберраций и рака.

Здесь мы описываем в vitro киназы assay который используется для идентификации конкретных Cdk1 фосфорилирования сайтов. В этот assay, очищенный белок является фосфорилированных в пробирке , коммерчески доступных человека Cdk1/циклин B. успешный фосфорилирование подтверждается SDS-PAGE, и впоследствии фосфорилирование сайты идентифицируются по масс-спектрометрии. Мы также описывают протоколы очищения, которые дают очень чистые и однородные белковых препаратов для assay киназы и пробирного привязки для функциональной проверки выявленных фосфорилирования сайтов, которые исследует взаимодействие между Классическая ядерной локализации сигнал (cNLS) и его перевозки ядерных рецепторов karyopherin α. Для помощи с экспериментального дизайна, мы рассматриваем подходы для прогнозирования фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов от белковых последовательностей. Вместе эти протоколы представляют очень мощный подход, который дает фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов и позволяет механистический исследования в как Cdk1 управляет клеточного цикла. Поскольку этот метод опирается на очищенные белки, может применяться к любой модели организма и дает надежные результаты, особенно в сочетании с функциональных исследований клеток.

Introduction

Киназы являются ферменты, которые регулируют многие клеточные процессы и передачи фосфатные группы от АТФ на субстраты. Этот фосфорилирование является обратимым, быстро, добавляет два отрицательными зарядами и хранит свободной энергии и является одним из наиболее распространенных Посттрансляционная изменений используется клетками. Cdk1, который также известен как гомолога белка 2 цикла деления клеток (cdc2) — это главный контроллер для клеточного цикла в всех эукариот^1,2,3,4,5и фосфорилирует оценкам, 8-13% ....

Protocol

1. Прогнозирование фосфорилирование Cdk1-конкретных сайтов из последовательности белка

1. Перед началом assay киназы, анализа последовательности белка для предсказал Cdk1-конкретных сайтов фосфорилирования и поиск литературы для экспериментально установленном фосфорилирование сайтов .......

Discussion

Наши в vitro киназы пробирного является очень мощный метод идентификации молекулярных целей для киназы Cdk1, который представляет собой главный контроллер клеточного цикла и регулирует многие важные клеточные процессы. Этот метод определяет, если очищенный белок является субстратом.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778