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Summary

Quinasa dependiente de ciclina 1 (Cdk1) está activado en la fase G2 del ciclo celular y regula muchas vías celulares. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de quinasa en vitro con Cdk1, que permite la identificación de sitios de fosforilación de Cdk1 específicos para establecer dianas celulares de esta quinasa importante.

Abstract

Quinasa dependiente de ciclina 1 (Cdk1) es un regulador principal para el ciclo celular en todos los eucariotas y fosforila un estimado 8-13% del proteoma; sin embargo, el número de objetivos identificados para la Cdk1, particularmente en las células humanas es todavía bajo. La identificación de sitios de fosforilación de Cdk1 específicos es importante, ya que proporcionan penetraciones mecánicas en cómo Cdk1 controla el ciclo celular. Regulación del ciclo celular es esencial para la segregación cromosómica fiel, y defectos en este complicado proceso conducen a aberraciones cromosómicas y cáncer.

Aquí, describimos un ensayo en vitro kinasa que se utiliza para identificar sitios de fosforilación de Cdk1-específicos. En este ensayo, un purificado de la proteína está fosforilada en vitro por disponible en el comercio humano Cdk1/ciclina B. exitoso fosforilación es confirmada por SDS-PAGE, y sitios de fosforilación son identificados posteriormente por espectrometría de masas. También describimos protocolos de purificación que preparados de proteína altamente puro y homogéneo adecuados para el ensayo de quinasa y una prueba de enlace para la verificación funcional de los sitios de fosforilación identificados, que puntas de prueba de la interacción entre una señal de localización nuclear clásica (LNC) y su transporte nuclear receptor karyopherin α. Para ayudar con el diseño experimental, se revisan los enfoques para la predicción de sitios de fosforilación de Cdk1-específicos de secuencias de la proteína. Juntos estos protocolos presentan un enfoque muy potente que produce sitios de fosforilación de Cdk1-específicos y permite estudios mecanísticos en cómo Cdk1 controla el ciclo celular. Puesto que este método se basa en proteínas purificadas, pueden aplicarse a cualquier organismo y rendimiento confiables resultados del modelo, especialmente cuando se combinan con estudios funcionales de la célula.

Introduction

Las quinasas son enzimas que transfiere grupos fosfato del ATP en sustratos y regulan muchos procesos celulares. Esta fosforilación es reversible, rápido, agrega dos cargas negativas y almacena la energía libre y es una de las modificaciones post-traduccionales más común utilizadas por las células. Cdk1, que también es conocido como homólogo de proteína 2 del ciclo de división celular (cdc2) es un controlador maestro para el ciclo celular en los eucariotas1,2,3,4,5y fosforila una Estimado 8-13% del proteoma....

Protocol

1. predicción de sitios de fosforilación de Cdk1-específicas de la secuencia de la proteína

  1. Antes de iniciar el análisis de la cinasa, analizar la secuencia de la proteína para sitios de fosforilación de Cdk1 específicos previstos y búsqueda de la literatura para los sitios de fosforilación experimentalmente establecido con especificidad desconocida quinasa. Utilice las siguientes herramientas, bases de datos y referencias que se resumen.
    1. Utilizar iGPS 3.0 software36

Representative Results

Recientemente hemos utilizado un en vitro ensayo quinasa (figura 1) para identificar sitios de fosforilación de Cdk1 específicos en un fragmento de CENP-F que contenía un LNC10. Esta señal le confiere localización nuclear de CENP-F durante la mayor parte de la interfase. En la fase G2, CENP-F se exporta del núcleo en el citosol en forma dependiente de Cdk1. Para obtener ideas mecanicistas sobre cómo Cdk1 regula la local.......

Discussion

Nuestro análisis de la cinasa en vitro es un método muy de gran alcance para identificar dianas moleculares para la quinasa Cdk1, que es un regulador maestro del ciclo celular y regula muchos procesos celulares importantes. El método determina si una proteína purificada es un sustrato para la Cdk1 y permite la identificación de sitios de fosforilación específicos. Esto facilita el estudio de mecanismos para la regulación de procesos celulares por fosforilación a través de Cdk1.

Acknowledgements

Agradecemos a Dr. David Rey, Howard Hughes Medical Institute, Universidad de California en Berkeley para el análisis de espectrometría de masas y comentarios útiles. Agradecemos a Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institutos de ciencias biológicas, Academia de Ciencias de China, Shanghai, China para proporcionar una larga duración construcción de CENP-F. Finalmente, agradecemos al Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan y Dr. Christof Grewer Universidad de Binghamton para acceso al equipo. Esta investigación fue financiada por la Fundación de investigación para la Universidad Estatal de Nueva York y el Departamento de química, Universidad Estatal de Nueva York en Binghamton.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2800 ml baffled Fernbach flaskCorning44232XL
ampicillinGold BiotechnologyA-301-25
ATPFisher ScientfiicBP413-25
benzamidine hydrochlorideMillipore SigmaB6506-25
bottletop filterCorning431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mLNew England BiolabsP6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)EMD Millipore14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)InvitrogenPV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK bufferNew England BiolabsP6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmidAvailable upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotorThermo Scientific10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranesEMD MilliporeUFC900324
chlorampenicolGold BiotechnologyC-105-100
D/L methionineAgros Organics / Fisher125650010
desalting pipet tips: Zip tipsMillipore SigmaZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cmBiorad7321010
dithiothreitolGold BiotechnologyDTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strainEMD Millipore71403
electrospray ionization Fourier transform ionBruker AmazonApex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometerBruker Amazoncustom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cyThermo Scientific97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLCGE Healthcare29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare28990944
glutathione agarosePierce16101
glutathione, reducedMillipore SigmaG4251-50g
incubation shaker: multitron shakerInforsI10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideGold BiotechnologyI2481C50
kanamycinGold BiotechnologyK-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmidAvailable upon request.
Luria Bertani mediumFisher ScientfiicBP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigeratedEppendorf5401000013
microtubes (0.5 ml)Eppendorf30121023
microtubes (1.5 ml)Eppendorf30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gelMillipore SigmaP6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmidMillipore SigmaGE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluorideGold BiotechnologyP470-10
PS protease: PreScission proteaseGE Healthcare27084301
Phos-tag acrylamideWako Pure Chem. Ind.304-93521
reduced gluthathioneMillipore SigmaG4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)Fisher Scientfiic055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange LightningAgilent210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifierBranson15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)Spectrum Labs08 670B
swing out rotor TX-1000Thermo Scientific10033-778

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