A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
Quinasa dependiente de ciclina 1 (Cdk1) está activado en la fase G2 del ciclo celular y regula muchas vías celulares. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de quinasa en vitro con Cdk1, que permite la identificación de sitios de fosforilación de Cdk1 específicos para establecer dianas celulares de esta quinasa importante.
Quinasa dependiente de ciclina 1 (Cdk1) es un regulador principal para el ciclo celular en todos los eucariotas y fosforila un estimado 8-13% del proteoma; sin embargo, el número de objetivos identificados para la Cdk1, particularmente en las células humanas es todavía bajo. La identificación de sitios de fosforilación de Cdk1 específicos es importante, ya que proporcionan penetraciones mecánicas en cómo Cdk1 controla el ciclo celular. Regulación del ciclo celular es esencial para la segregación cromosómica fiel, y defectos en este complicado proceso conducen a aberraciones cromosómicas y cáncer.
Aquí, describimos un ensayo en vitro kinasa que se utiliza para identificar sitios de fosforilación de Cdk1-específicos. En este ensayo, un purificado de la proteína está fosforilada en vitro por disponible en el comercio humano Cdk1/ciclina B. exitoso fosforilación es confirmada por SDS-PAGE, y sitios de fosforilación son identificados posteriormente por espectrometría de masas. También describimos protocolos de purificación que preparados de proteína altamente puro y homogéneo adecuados para el ensayo de quinasa y una prueba de enlace para la verificación funcional de los sitios de fosforilación identificados, que puntas de prueba de la interacción entre una señal de localización nuclear clásica (LNC) y su transporte nuclear receptor karyopherin α. Para ayudar con el diseño experimental, se revisan los enfoques para la predicción de sitios de fosforilación de Cdk1-específicos de secuencias de la proteína. Juntos estos protocolos presentan un enfoque muy potente que produce sitios de fosforilación de Cdk1-específicos y permite estudios mecanísticos en cómo Cdk1 controla el ciclo celular. Puesto que este método se basa en proteínas purificadas, pueden aplicarse a cualquier organismo y rendimiento confiables resultados del modelo, especialmente cuando se combinan con estudios funcionales de la célula.
Las quinasas son enzimas que transfiere grupos fosfato del ATP en sustratos y regulan muchos procesos celulares. Esta fosforilación es reversible, rápido, agrega dos cargas negativas y almacena la energía libre y es una de las modificaciones post-traduccionales más común utilizadas por las células. Cdk1, que también es conocido como homólogo de proteína 2 del ciclo de división celular (cdc2) es un controlador maestro para el ciclo celular en los eucariotas1,2,3,4,5y fosforila una Estimado 8-13% del proteoma....
1. predicción de sitios de fosforilación de Cdk1-específicas de la secuencia de la proteína
Recientemente hemos utilizado un en vitro ensayo quinasa (figura 1) para identificar sitios de fosforilación de Cdk1 específicos en un fragmento de CENP-F que contenía un LNC10. Esta señal le confiere localización nuclear de CENP-F durante la mayor parte de la interfase. En la fase G2, CENP-F se exporta del núcleo en el citosol en forma dependiente de Cdk1. Para obtener ideas mecanicistas sobre cómo Cdk1 regula la local.......
Nuestro análisis de la cinasa en vitro es un método muy de gran alcance para identificar dianas moleculares para la quinasa Cdk1, que es un regulador maestro del ciclo celular y regula muchos procesos celulares importantes. El método determina si una proteína purificada es un sustrato para la Cdk1 y permite la identificación de sitios de fosforilación específicos. Esto facilita el estudio de mecanismos para la regulación de procesos celulares por fosforilación a través de Cdk1.
Agradecemos a Dr. David Rey, Howard Hughes Medical Institute, Universidad de California en Berkeley para el análisis de espectrometría de masas y comentarios útiles. Agradecemos a Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institutos de ciencias biológicas, Academia de Ciencias de China, Shanghai, China para proporcionar una larga duración construcción de CENP-F. Finalmente, agradecemos al Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan y Dr. Christof Grewer Universidad de Binghamton para acceso al equipo. Esta investigación fue financiada por la Fundación de investigación para la Universidad Estatal de Nueva York y el Departamento de química, Universidad Estatal de Nueva York en Binghamton.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2800 ml baffled Fernbach flask | Corning | 44232XL | |
ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-25 | |
ATP | Fisher Scientfiic | BP413-25 | |
benzamidine hydrochloride | Millipore Sigma | B6506-25 | |
bottletop filter | Corning | 431161 | |
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL | New England Biolabs | P6020 | |
Cdk1/cyclin B (alternate source) | EMD Millipore | 14-450 | |
Cdk1/cyclin B (alternate source) | Invitrogen | PV3292 | |
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer | New England Biolabs | P6020 | |
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid | Available upon request. | ||
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor | Thermo Scientific | 10033-778 | |
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes | EMD Millipore | UFC900324 | |
chlorampenicol | Gold Biotechnology | C-105-100 | |
D/L methionine | Agros Organics / Fisher | 125650010 | |
desalting pipet tips: Zip tips | Millipore Sigma | ZTC18S008 | |
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm | Biorad | 7321010 | |
dithiothreitol | Gold Biotechnology | DTT50 | |
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain | EMD Millipore | 71403 | |
electrospray ionization Fourier transform ion | Bruker Amazon | Apex III | |
cyclotron resonance mass spectrometer | |||
electrospray ionization ion trap mass spectrometer | Bruker Amazon | custom | |
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy | Thermo Scientific | 97040-276 | |
FPLC system: Äkta Pure FPLC | GE Healthcare | 29032697 | |
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
glutathione agarose | Pierce | 16101 | |
glutathione, reduced | Millipore Sigma | G4251-50g | |
incubation shaker: multitron shaker | Infors | I10102 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
kanamycin | Gold Biotechnology | K-120-25 | |
karyopherin α pet-28a pres plasmid | Available upon request. | ||
Luria Bertani medium | Fisher Scientfiic | BP1426-2 | |
microcentrifuge 5418R, refrigerated | Eppendorf | 5401000013 | |
microtubes (0.5 ml) | Eppendorf | 30121023 | |
microtubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30120086 | |
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel | Millipore Sigma | P6611-100ml | |
pGEX-6P-1 plasmid | Millipore Sigma | GE28-9546-48 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Gold Biotechnology | P470-10 | |
PS protease: PreScission protease | GE Healthcare | 27084301 | |
Phos-tag acrylamide | Wako Pure Chem. Ind. | 304-93521 | |
reduced gluthathione | Millipore Sigma | G4251-50g | |
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) | Fisher Scientfiic | 055291D | |
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning | Agilent | 210518 | |
Site-Directed Mutagenesis Kit | |||
sonifier: Branson S-250D sonifier | Branson | 15 338 125 | |
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) | Spectrum Labs | 08 670B | |
swing out rotor TX-1000 | Thermo Scientific | 10033-778 |
This article has been published
Video Coming Soon
ISSN 2578-2037
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.