Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Summary

Cyklin-beroende kinase 1 (Cdk1) aktiveras i den G2-fasen i cellcykeln och reglerar många cellulära vägar. Här presenterar vi ett protokoll för en in vitro- Kinas analys med Cdk1, som möjliggör identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser för fastställande av cellulära mål denna viktigt-Kinas.

Abstract

Cyklin-beroende kinase 1 (Cdk1) är en master controller för cellcykeln i alla eukaryota organismer och phosphorylates uppskattningsvis 8-13% av proteomet; antalet fastställda mål för Cdk1, särskilt i mänskliga celler är dock fortfarande låg. Identifiering av Cdk1-specifika fosforylering platser är viktigt, eftersom de ger mekanistiska insikter i hur Cdk1 styr cellcykeln. Cellcykelns reglering är kritiska för trogna kromosomsegregering och defekter i denna komplicerade process leda till kromosomavvikelser och cancer.

Här beskriver vi en in vitro- Kinas analysmetod som används för att identifiera Cdk1-specifika fosforylering platser. I denna analys, är ett renat protein fosforyleras i vitro av kommersiellt tillgängliga mänskliga Cdk1/cyklin B. framgångsrika fosforylering bekräftas av SDS-PAGE, och fosforylering platser identifieras därefter med masspektrometri. Vi beskriver också rening protokoll som ger mycket ren och homogen protein preparat passar kinase analysen, och en bindande analys för funktionell kontroll av de identifiera fosforylering webbplatser, som sonder samspelet mellan en klassisk cellkärnelokalisering signal (cNLS) och dess nukleära transporter receptor karyopherin α. För att underlätta med experimentell design, granskar vi metoder för förutsägelse av Cdk1-specifika fosforylering platser från proteinsekvenser. Tillsammans ger dessa protokoll en mycket kraftfull metod som ger Cdk1-specifika fosforylering platser och möjliggör mekanistiska studier i hur Cdk1 styr cellcykeln. Eftersom denna metod förlitar sig på renade proteiner, kan det tillämpas på modellen organism och avkastning tillförlitliga resultat, särskilt i kombination med cell funktionella studier.

Introduction

Kinaser är enzymer som transfererar fosfat från ATP på substrat och reglerar många cellulära processer. Detta fosforylering är reversibel, snabb, lägger två negativa laddningar, och lagrar fri energi och är en av de vanligaste posttranslationell ändringar används av celler. Cdk1, som också kallas cell division cycle protein 2 homolog (cdc2) är en master controller för cellcykeln i alla eukaryota organismer^1,2,3,4,5, och phosphorylates en uppskattningsvis 8-13% av proteomet^6,

Protocol

1. förutsägelse av Cdk1-specifika fosforylering platser från proteinsekvens

1. Innan du börjar Kinas analysen, analysera protein sekvensen för förutsedda Cdk1-specifika fosforylering webbplatser och Sök litteraturen för experimentellt fastställda fosforylering platser med okänd kinase specificitet. Använd följande verktyg, databaser och referenser som resumeras.
   1. Använda de iGPS 3.0 programvara^36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.......

Discussion

Vår i vitro kinase analysen är en mycket kraftfull metod att identifiera molekylära mål för Kinas Cdk1, som är en master controller av cellcykeln och reglerar många viktiga cellulära processer. Metoden avgör om ett renat protein är ett substrat för Cdk1 och tillåter identifiering av specifika fosforylering platser. Detta underlättar mekanistiska studier för reglering av cellulära processer genom fosforylering via Cdk1.

Den mest kritiska faktorn för framgångsrik identi.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778