Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Summary

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Abstract

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün bütün Ökaryotlarda bir ana denetleyicisidir ve Proteom yaklaşık 8-%13 phosphorylates; Ancak, özellikle insan hücrelerinde Cdk1 için belirlenen hedeflerin sayısı hala düşük. Nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol içine mekanik anlayışlar sağladıkları gibi Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlanması önemlidir. Hücre döngüsü Yönetmeliği sadık kromozom ayrımı için önemlidir ve bu karmaşık bir süreç içinde kusurları kromozom anomalileri ve kanser neden.

Burada, biz Cdk1 özgü fosforilasyon siteleri tanımlamak için kullanılan bir vitro kinaz tahlil açıklayın. Bu tahlil fosforile vitro arıtılmış bir proteindir ticari olarak mevcut insan Cdk1/siklin B. başarılı tarafından fosforilasyon SDS-PAGE tarafından onaylandıktan ve fosforilasyon siteleri daha sonra kütle spektrometresi tarafından tanımlanır. Ayrıca son derece saf ve homojen protein kinaz tahlil ve bağlama tahlil için uygun hazırlıklar arasındaki etkileşimi probları tanımlanan fosforilasyon siteleri fonksiyonel doğrulanması için verim arıtma iletişim kurallarını açıklar bir klasik nükleer yerelleştirme sinyal (cNLS) ve onun nükleer taşıma reseptör karyopherin α. Deneysel tasarım ile yardımcı olmak için protein dizilerinden Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tahmin için yaklaşımlar gözden geçirin. Birlikte bu protokollerin Cdk1 özgü fosforilasyon siteler verimleri ve mekanik çalışmaları nasıl Cdk1 hücre döngüsü kontrol eder içine sağlayan çok güçlü bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntem üzerinde saf protein dayanıyor beri bu herhangi bir model organizma ve verimleri güvenilir sonuçlar için özellikle hücre fonksiyonel çalışmalar ile birlikte uygulanabilir.

Introduction

Kinazlar fosfat grupları ATP yüzeyler transfer ve birçok hücresel süreçler düzenleyen enzimlerdir. Bu fosforilasyon geri alınabilir, hızlı, iki negatif ücretleri, ekler ve serbest enerji depolar ve hücreleri tarafından kullanılan en yaygın ardından değişiklikler biridir. Hücre bölünmesi döngüsü protein 2 homolog (cdc2) olarak da bilinen olan Cdk1 hücre döngüsünün bütün Ökaryotlar^1,2,3,4,5ana bir denetleyicisidir ve phosphorylates bir yaklaşık 8-%13 Proteom^6,

Protocol

1. tahmini Protein serisinden Cdk1 özgü fosforilasyon sitelerin

1. Kinaz tahlil başlamadan önce tahmin edilen Cdk1 özgü fosforilasyon siteler için protein sırasını analiz ve bilinmeyen kinaz özgüllük ile edebiyat deneysel olarak kurulan fosforilasyon siteler için arama. Aşağıdaki araçlar, veritabanları ve özetlenen başvuruları kullanın.
   1. Üreticisinin 3.0 yazılım^36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) Cdk1 özgü fo.......

Discussion

Bizim vitro kinaz tahlil hangi hücre döngüsünün ana denetleyicisi ve birçok önemli hücresel süreçler düzenleyen kinaz Cdk1, moleküler hedefleri tanımlamak için çok güçlü bir yöntem olduğunu. Yöntem bir saf protein bir substrat Cdk1 için ve belirli fosforilasyon sitelerin kimlik sağlar Eğer belirler. Bu Cdk1 aracılığıyla fosforilasyon tarafından mekanik çalışmaları, düzenleme, hücresel süreçler için kolaylaştırır.

En kritik kütle spektrometresi.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2800 ml baffled Fernbach flask	Corning	44232XL
ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-25
ATP	Fisher Scientfiic	BP413-25
benzamidine hydrochloride	Millipore Sigma	B6506-25
bottletop filter	Corning	431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL	New England Biolabs	P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)	EMD Millipore	14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)	Invitrogen	PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer	New England Biolabs	P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid	Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor	Thermo Scientific	10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes	EMD Millipore	UFC900324
chlorampenicol	Gold Biotechnology	C-105-100
D/L methionine	Agros Organics / Fisher	125650010
desalting pipet tips: Zip tips	Millipore Sigma	ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm	Biorad	7321010
dithiothreitol	Gold Biotechnology	DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain	EMD Millipore	71403
electrospray ionization Fourier transform ion	Bruker Amazon	Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer	Bruker Amazon	custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy	Thermo Scientific	97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC	GE Healthcare	29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
glutathione agarose	Pierce	16101
glutathione, reduced	Millipore Sigma	G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker	Infors	I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Gold Biotechnology	I2481C50
kanamycin	Gold Biotechnology	K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid	Available upon request.
Luria Bertani medium	Fisher Scientfiic	BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated	Eppendorf	5401000013
microtubes (0.5 ml)	Eppendorf	30121023
microtubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel	Millipore Sigma	P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid	Millipore Sigma	GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride	Gold Biotechnology	P470-10
PS protease: PreScission protease	GE Healthcare	27084301
Phos-tag acrylamide	Wako Pure Chem. Ind.	304-93521
reduced gluthathione	Millipore Sigma	G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)	Fisher Scientfiic	055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning	Agilent	210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier	Branson	15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)	Spectrum Labs	08 670B
swing out rotor TX-1000	Thermo Scientific	10033-778