وأيد هذا البحث منح المعاهد الوطنية للصحة/نييد AI112423 والمعاهد الوطنية للصحة/نيجمس GM113885 لبنيامين ك. تشن والمعاهد الوطنية للصحة/نييد K08-AI120806 إلى شوارتز H. تاليا. نود أن نشكر "كلية الطب آيكان" في جبل سيناء عميد التدفق "الخلوي الأساسية".

1-جيل خطوط الخلايا المستهدفة
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية؛ في حالة استخدام خط خلية هدف الحقيقي موجود، ابدأ في الخطوة 2.
<ol><li>كوترانسفيكت لوحة المتلاقية 10 سم 70% من الخلايا 293T11 ] في 10 مل من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)] مع بمسكفلوكسبدسر...

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+enzyme-based+assay+detecting+HIV-1+virion+fusion+in+primary+T+lymphocytes.">A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes.</a> Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).</li><li>Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+envelope-dependent+cell-cell+fusion:+a+quantitative+fluorescence+cytometric+assay.">Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay.</a> Cytometry. 47, 100-106 (2002).</li><li>Sakamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+HIV+cell-cell+fusion+assay+by+using+two+genetically+modified+HeLa+cell+lines+and+reporter+gene.">Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene.</a> Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).</li><li>Herschhorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+cell-cell+fusion+system+with+integrated+ability+to+measure+the+efficiency+and+specificity+of+HIV-1+entry+inhibitors.">An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors.</a> PLoS One. 6, e26731 (2011).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+HIV-Cell+Fusion+Assay+for+Discovery+of+Virus+Entry+Inhibitors.">High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).</li><li>Giroud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Functional+Profiling+of+Small-Molecule+HIV-1+Entry+and+Fusion+Inhibitors.">Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).</li><li>Hubner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9, 81-83 (2011).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+Rapid+production+of+helper-free,+high+titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Phosphate+Transfection.">Calcium Phosphate Transfection.</a> Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).</li></ol>

والرزن هفوة-الجماعات ثبت أن تكون مفيدة جداً لفحص المرشحين المخدرات التي قد تعوق الخطوة الانصهار للنسخ المتماثل الفيروسية. عند إجراء هذا الفحص، تتشابه الخطوات الأكثر أهمية للحصول على إشارة جيدة لفحوصات العدوى الفيروسية أكثر. أن الخطوة الحاسمة الأولى إنتاج التتر عالية من الفيروسات ذات ال?...

ودفعت الحاجة إلى العلاج المضاد للفيروسات الرجعية رواية تطوير شاشات الفائق لمثبطات دخول فيروس نقص المناعة البشرية-1. هو وضع مقايسة مراسل هفوة-الجماعات تحديد مثبطات دخول الفيروسية في الخطوة الانصهار في نظام خلية إلى إصابة بقياس الانصهار الغشاء الفيروسي مع غشاء الخلية المضيفة1على وجه التحديد. تم وضع فحص على الشاشة لمثبطات الرواية التي تصرف على وجه التحديد في المراحل المبكرة من الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 حتى نقطة الانصهار الغشاء الفيروسي. تحدي واحد لقياس عدوى خلية خلية أن العدوى الأولية يحتوي على خلايا المانحين المصابة والخلايا الهدف إينينفيكتيد، ذلك قياس الإصابات الجديدة من الصعب أن تميز من خلايا الإدخال. النظام المثالي ينطوي على علامة مغايرة جينات التي يمكن أن يتسبب قبل الشروع في عدوى الخلية المستهدفة وهي غير موجودة في الخلية المانحة. محتويات فيروسية شعبية خلط المقايسة استناداً إلى انصهار إنزيم بروتين فيروسي، BlaM-Vpr، يمكن أن تكون فعالة، ولكن القيود لارتفاع الإنتاجية، فحص الخلايا2. ويشمل هذا التحليل جين مراسل بيتا-lactamase (BlaM) التي تنصهر فيها فيروس نقص المناعة البشرية-1 Vpr، في فيريونس وتعبئتها، وتسليمها إلى خلايا الهدف عند الانصهار الغشاء الفيروسي. الركيزة CCF2-صباحا تم تحميله إلى السيتوبلازم للخلايا المستهدفة ويخضع لتحول الأسفار عند الانقسام. الركيزة صباحا CCF2 مكلفة ويمكن أن تكون باهظة بالنسبة للشاشات الفائق. لتمييز الخلايا المستهدفة والجهات المانحة، من الضروري أن صبغ-تسمية السكان المستهدفين. وأخيراً، البروتوكول يتطلب العديد من الخطوات الغسيل والحضانة التي يمكن أن تكون مرهقة ومكلفة عند اختبار عدد كبير من المركبات.
وقد وضعت المقايسة هفوة-الجماعات كحل لهذه المسائل، لتطوير الفائق الفرز لمثبطات للانصهار في خلية إلى انتقال. لا يتطلب هذا النظام الركازة تحميلها إلى الخلايا. يمكن أن تستخدم أيضا لدراسات الخلية الحرة المقايسة وقابل للتكيف إلى دراسات أخرى الانصهار الفيروسية باستخدام جزيئات الفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات شبه مكتوب. يمكن قياس فيروس نقص المناعة البشرية الحياة الفطرية بوساطة خلية خلية الانصهار فحوصات فيروس الحياة الفطرية الخلية البروتين بوساطة الانصهار، بيد أن هذه لا تستخدم جزيئات الفيروس الفعلية كما يفعل فحص فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات3،،من45. ويمكن قراءة هذا التحليل مع التدفق الخلوي أو الأسفار مجهرية. قد تم استخدمت بنجاح شاشة المكتبة إدارة الأغذية والعقاقير، فضلا عن مكتبة صغيرة بورينيرجيك مثبطات1،6. غيرها من المحققين قد حددت أيضا مثبطات بورينيرجيك في الانصهار فيروس نقص المناعة البشرية-1 استخدام مقايسة انصهار الفائق تكييف والأمثل أن التقارير عن نقل الفيروس مغلفة بيتا-lactamase إلى7،السيتوبلازم8 .
وقد صمم الفيروس هفوة-الجماعات مع نهج مماثل للفيروس هفوة-إيجفب، وإدراج recombinase لجنة المساواة العرقية بين المصفوفة وقفيصه، الذي كان واقفاً إلى جانب فيروس نقص المناعة البشرية-1 مبطلات مواقع9. يرصد الإنزيم لجنة المساواة العرقية كسلائف إدراجها ضمن بوليبروتين هفوة أن ينضج عندما يتم تنشيط فيروس نقص المناعة البشرية-1 مبطلات داخل جسيمات الفيروس الوليدة. وهكذا، تسليم لجنة المساواة العرقية تعتمد على إيصال محتويات الجسيمات فيروس نقص المناعة البشرية-1 المنشط في حوزتي في هدف خلية عن طريق عملية انصهار غشاء فيروسي. وترد هنا إصدارين من البروتوكول. يستخدم الأول سكان المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 لتصيب الخلايا الهدف، لدراسة انتقال الفيروس مباشرة من خلية إلى خلية. يستخدم الإصدار الثاني فيروس الخلية الحرة لدراسة التهاب فيروسي خالية من الخلية. والرزن نقل خلية إلى خلية يأخذ 7 أيام كاملة من اليوم الذي يتم إذابة الخلايا، أو 5 أيام إذا كان الفعل إذابة الخلايا وباساجيد. يمكن إجراء فحص الإصابة بالخلية الحرة في 5 أيام إذا كانت الخلايا بحاجة إلى أن يكون مذاب و 3 أيام إذا إذابة الخلايا وباساجيد. كما تعطي تعليمات لإنشاء خط خلية مستهدفة (من الأحمر إلى الأخضر) النمو الحقيقي في نوع الخلايا المطلوب (إذا لم يتم استخدام خط خلية هدف الحقيقي الموجودة مسبقاً) باستخدام بلازميد تم إنشاؤها بواسطة مختبر كليفيرس10. من المستحسن اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة مع الفيروس والخلايا معربا عن الفيروس في هذا التحليل. نقوم بإجراء الجزء المعدية لهذا الفحص في منشأة لزراعة الأنسجة BSL2 +. بعد أن يتم إصلاح الخلايا، يمكن أن تحلل في المرافق القياسية التدفق الخلوي والفحص المجهري.
هنا يصف لنا تطبيق هذا التحليل على الشاشة لرواية المركبات التي تثبط فيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار (الشكل 1). مستقبلات بورينيرجيك من الوسطاء المحترفين التحريضية. لدينا مختبر أظهرت أن مثبطات غير انتقائي لمستقبلات بورينيرجيك تعمل كمثبطات لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار6. ونحن التقرير أن الاستفادة من هذا التحليل في إنتاجية عالية يمكن التعرف على رواية مثبطات الانصهار في الغشاء الفيروسي فيروس نقص المناعة البشرية-1. علينا أن نظهر أن المانع الفئة بورينيرجيك مستقبلات يمثل فئة جديدة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار مثبطات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td>Media for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R0883</td>
			<td>Media for Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140-071</td>
			<td>Serum for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Serum for Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Penn/Strep used in both media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td>Used for Culture of Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm Tissue Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>Used for Culture of 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>Used for fusion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyjet Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Used to transfect 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-100ML</td>
			<td>Used in wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypsin Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>For Trypsinization of 293 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For all tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P3020-CPS</td>
			<td>For all tissue culture and liquid handling steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter (0.45 micron)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHA033</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile syringes</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>309656</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2b</td>
			<td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>for flow cytometry analyss of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td>Fortessa 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>32702</td>
			<td>Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL10a1</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NBP2-29542</td>
			<td>Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag-iCre</td>
			<td>Benjamin Chen Lab</td>
			<td></td>
			<td>Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

هذا التحليل يهدف إلى تحديداً تقرير بشأن فيروس نقص المناعة البشرية-1 الانصهار عبر التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) يمكن كشفها بالفحص المجهري التدفق الخلوي أو الأسفار. فيروس نقص المناعة البشرية-1 مراسل فيروس (فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات) تم إنشاؤه بواسطة إدراج recombinase لجنة المساواة العرقية في جينوم فيروس نقص المناعة البشرية-1 بين المصفوفة وبروتينات قفيصه من بوليبروتين اسكت. هذه النتائج في عبوة من ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية إلى جزيئات الفيروس، الذي صدر بعد ذلك في خلية مستهدفة خط ثابت معربا عن لجنة المساواة العرقية تنشيط recombinase أحمر نيون بروتين (RFP) إلى كاسيت التبديل بروتينات فلورية خضراء. في الدولة القاعدية، ويعرب هذا الكاسيت عن طلب تقديم العروض فقط. عقب تسليم recombinase لجنة المساواة العرقية إلى الخلية الهدف، طلب تقديم العروض، يحف به مواقع لوكسب، المكوس، أسفر عن تعبير بروتينات فلورية خضراء. هذا التحليل يمكن استخدامها لاختبار أي مثبطات دخول الفيروسية (على وجه التحديد في الخطوة الانصهار) في نظم خالية من خلية وخلية إلى الإصابة، وقد استخدمت لتحديد فئة من الخصوم مستقبلات بورينيرجيك كمثبطات جديدة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار.

معرض RG مصابة "جوركات الخلايا" على مستوى منخفض من خلفية بروتينات فلورية خضراء إشارة (0.3 في المائة) مع إشارة قوية جداً طلب تقديم العروض (الشكل 2A، العمود غير مصاب). العدوى مع الجماعات هفوة يسبب زيادة في التجارة والنقل إشارة (24.9%)، مع وجود المانع الانصهار فيروس ن?...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion at JoVE.com

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

يصف لنا تحليل يستند إلى الخلية تقرير بشأن فيروس نقص المناعة البشرية-1 الانصهار عبر التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء القابلة للكشف المجهري التدفق الخلوي أو الأسفار. ويمكن استخدامه لاختبار مثبطات دخول الفيروسية (على وجه التحديد في الخطوة الانصهار) في نظم خالية من خلية وخلية إلى الإصابة.

Cre-لوكس الفائق تنشيط الإنزيم الانصهار الغشاء الفيروسي التعرف على مثبطات للانصهار الغشاء الفيروسي فيروس نقص المناعة البشرية-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

This method can help answer key questions in the HIV entry field such as drug discovery and identification of factors required for HIV fusion. The main advantage of this technique is that it can be scaled for high throughput screening. This technique can be used to screen large libraries of compounds to identify drugs that target early stages of the HIV-1 life cycle.This method can also be used to study HIV fusion inhibitors in animal models such as humanized mice. Researchers should follow biosafety precautions with infectious HIV-1. This is a recombinant full-length viral clone that does not replicate in multiple rounds, but must be approved by your biosafety office.To begin this procedure, thaw one 500 microliter vial of Jurkat RG reporter cells by placing it into a 37 degree Celsius water bath. Pipette the cells from the vial into 10 milliliters of RPMI complete medium and then centrifuge the mixture at 800 times gravity for five minutes at 23 degrees Celsius. Resuspend the pellet in 20 milliliters of RPMI complete medium and transfer the cell suspension to a T75 flask.Incubate the flask at 37 degrees Celsius overnight. On the following day, add 0.5 micrograms per milliliter of Puromycin to the cells in the flask. Culture the cells maintaining a density of 200, 000 to 800, 000 cells per milliliter.On the day prior to setting up the transfer assay, split the cells down to 200, 000 to 400, 000 cells per milliliter in fresh RPMI medium containing 0.5 micrograms per milliliter of Puromycin. Grow the cells overnight. To prepare the donor cells for cell-to-cell virus transmission, thaw untransduced Jurkat cells and culture them in a T75 flask with 20 milliliters of RPMI complete medium keeping the density of 200, 000 to 800, 000 cells per milliliter.Centrifuge 7, 500, 000 cells at 800 times gravity for five minutes. Discard the supernatant and resuspend the cells in 120 microliters of Nucleofector Solution V with supplement. Transfer the cells to an electroporation cuvette and add 4.5 micrograms of Gag-iCre DNA.Electroporate the cells using an appropriate program and then immediately transfer the cells to three milliliters of RPMI medium with 10%FBS. Allow the cells to recover by incubating them at 37 degrees Celsius with 5%CO2 overnight. On the following morning, pipette two milliliters of Ficoll into a 15 milliliter conical tube.Slowly pipette the three milliliters of cells from the six-well plate on top of the Ficoll. Centrifuge the cells at 800 times gravity for five minutes at 23 degrees Celsius and transfer the cells from the interface Ficoll media interface to three milliliters of RPMI complete medium in a six-well plate. Allow the cells to recover at 37 degrees Celsius for two hours before proceeding with the assay setup.Start this procedure by using a hemocytometer to count both the donor and target cells. Then spin down 50, 000 cells per well to be assayed of both donor and target cells. Resuspend one times 10 to the sixth cells per milliliter in RPMI complete medium without Puromycin.In a 96-well plate, add 25 microliters of donor cell suspension to each well. In another 96-well plate, add 25 microliters of target cell suspension per well. To each well, add 25 microliters of the test compound diluted in RPMI complete medium at the appropriate concentration.Incubate the donor and target cells with the compound for 30 minutes. After the 30-minute pretreatment, combine the donor cells with the target cells by pipetting the contents of one plate into the other plate and incubating the cells in a tissue culture incubator for 40 hours. To fix the cells, add paraformaldehyde to each well to a final concentration of 2%Subsequently, analyze the cells on a flow cytometer with mCherry and FITC channels.In addition, visualize the GFP signal via fluorescence microscopy at 40X magnification on GFP-specific channels. Uninfected RG Jurkat cells exhibit a low level of background GFP signal with a very strong RFP signal. Cell-free infection with Gag-iCre causes an increase in GFP signal.The presence of the HIV-1 fusion inhibitor AMD3100 inhibits the development of GFP signal bringing it down to uninfected background levels. When an inhibitor of a post-fusion event such as the reverse transcription inhibitor AZT is used, the signal is not affected significantly indicating that the GFP signal produced by the assay is specific to the HIV-1 fusion. In a cell-to-cell infection assay, RG Jurkat cells were mixed with Jurkat cells transfected with HIV-1 Gag-iCre.In addition to AMD3100, a nonselective purinergic inhibitor PPADS was tested for its ability to block viral membrane fusion at 100 micromolar. The results indicate a dose-dependent inhibition of Gag-iCre fusion with PPADS. While attempting this procedure, it's important to keep the cells within exponential growth range for both virus production and infection.Using overgrown cells will result in a dramatic decrease in signal from this assay. Don't forget that working with HIV can be hazardous. BSL two practices as indicated by your institution should be always taken while performing this procedure.