Dynamisk proteom og miRNA analyse af Polysomes fra isolerede mus hjertet efter Langendorff Perfusion

Undersøgelser i dynamiske ændringer i protein oversættelse kræver specialiserede metoder. Her undersøgte vi ændringer i nyligt syntetiseret proteiner i svar til iskæmi og reperfusion ved hjælp af isolerede perfunderet mus hjertet kombineret med polysome profilering. For yderligere at forstå de dynamiske ændringer i protein oversættelse, vi kendetegnet den mRNAs, der var lastet med cytosole ribosomer (polyribosomes eller polysomes) og også tilbagebetalte mitokondrie polysomes og sammenlignet mRNA og protein fordeling i de højeffektiv fraktioner (mange ribosomer knyttet til mRNA), lav-effektivitet (færre ribosomer vedlagt), der også omfattede mitokondrie polysomes, og de ikke-oversætte fraktioner. miRNAs kan også knytte mRNAs, der er ved at blive oversat, hvorved effektiviteten af oversættelse, vi undersøgte distribution af miRNAs på tværs af fraktioner. Fordelingen af mRNAs, miRNAs og proteiner blev undersøgt på basal perfunderet betingelser, i slutningen af 30 min globale no-flow iskæmi, og efter 30 min af reperfusion. Her præsenterer vi de metoder, der anvendes til at udføre denne analyse — navnlig tilgang til optimering af protein udvinding fra saccharose gradient, da dette er ikke blevet beskrevet før — og give nogle repræsentative resultater.