هذا العمل كان يدعمها "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (148808 و 148792)، وأيده سراج الدين القلب ومؤسسة السكتة الدماغية، ومنح الموظفين من مكتب مقاطعة أونتاريو، وآذار/مارس من الدايمات، تيد روجرز مركز بحوث القلب ومونك بيتر مركز القلب. XCC حاصل على "زمالة بانتنغ استوفوا". لوس أنجليس يحمل القلب والسكتة الدماغية/ريتشارد لور منحة جائزة.

بيان الأخلاق: تم استعراض هذا البروتوكول والتي أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان" في "الشبكة الصحية جامعة" (تورنتو، كندا)، وامتثالا "المجلس الكندي للعناية بالحيوان".
1. إعداد المخزن المؤقت
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت لسداسي البروم ثنائي الفينيل (موازنة الملح الحل (حبس هانك)، مصل بقرى ?...

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

التهاب عضلة القلب، أو التهاب العضلة القلبية، ميزة لأمراض القلب والأوعية الدموية أكثر. بيد أن عضلة القلب لا يخلو من مكوناته المناعية في الحالات غير المرضية. أثناء حالة ثابتة، العديد من الخلايا المناعية الموجودة في عضلة القلب ولعب أدوار أساسية لصون وحماية. لم يكن وصف هؤلاء السكان متنوعة من ...

أشكال مختلفة من احتشاء عضلة القلب من الإجهاد أو الإصابة، بما في ذلك الدماغية (ضخه الاسكيمية أو احتشاء عضلة القلب) وغير الدماغية (ارتفاع ضغط الدم أو التهاب العضلة القلبية)، تشجيع تعيين الخلايا الملتهبة مع الترميمي والحماية، لكن أيضا الخصائص المسببة للأمراض. أقرب 1891، رومبيرغ أول وصف وجود تتسرب الخلوية في عضلة القلب للمرضى المصابين ب التيفوس والحمى القرمزية1. بيد أن الدراسة التفصيلية للخلايا المناعية القلب يتطلب تطوير تقنيات أكثر تطورا إيمونوفينوتيبينج. نتيجة لذلك، إلا في الآونة الأخيرة قد بدأنا على فهم أن عدد سكان متنوعة من الخلايا المناعية مع أدوار الصيانة الضرورية أثناء حالة ثابتة يتواجد داخل عضلة القلب.
وقد علم الأنسجة، ولا يزال، الأسلوب الأكثر شيوعاً لتوصيف الخلايا المناعية القلب أثناء التهاب. ومع ذلك، حين علم الأنسجة يمثل أداة قيمة لتشخيص، استخدامه في دراسة الخلايا المناعية القلب قد القيود الهامة. تمثل نسبة ضئيلة جداً من مجموع الخلايا الخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب وهي أكثر أو أقل موزعة في مساحة كبيرة نسبيا. وبالمثل، تظهر عدة أشكال من التهاب القلب، مثل فيروسي التهاب العضلة القلبية، أنماط التنسيق من التهاب. وهذا يعني أن التحليل الدقيق للنظام المناعي للقلب غالباً ما تتطلب درجة أعلى من أخذ عينات نسيجية، زيادة التكلفة للحد من التحيز. وعلاوة على ذلك، يوفر علم الأنسجة كمية محدودة جداً من المعلومات يمكن استخدامها في تحديد الخلية (مثل عدد المعلمات). مع عدد متزايد من أي وقت مضى من مجموعات فرعية الخلية التي تتطلب استخدام عدة علامات التعبير (بما في ذلك علامات السطحية أو عوامل النسخ أو جزيئات يفرزها)، التدفق الخلوي أثبتت أنها أقوى أداة إيمونوفينوتيبينج، سبب منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية.
باستخدام تقنيات إيمونوفينوتيبينج يتوقف عن كثب على تطوير كفاءة الهضم البروتوكولات التي تسمح بتحليل خلايا مفردة لإعداد كبيرة من الخلايا. وضع بروتوكولات شاملة لاستخراج خلية فتح نافذة جديدة من الفرص في دراسة علم المناعة القلب. من خلال المزيج من الهضم، والتدفق الخلوي وترانسكريبتوميكس، كان السكان الرئيسية في الضامة، والخلايا الجذعية الذين يقيمون في القلب تتسم2،3. السكان الأكثر وفرة من الخلايا المناعية القلب أثناء حالة ثابتة هي CD64+ميرتك+ الضامة، التي يمكن تقسيمها استناداً إلى التعبير عنها من CCR2 أو CD11c2. CCR2+ الضامة تنبع من هيماتوبويسيس نخاع العظام الكبار، بينما الأغلبية من CCR2 الضامة– ، التي يمكن أن تعبر عن مستويات عالية أو منخفضة من MHC-ثانيا، هم أساسا من أصل قبل الولادة. الضامة المهام الرئيسية مثل إصلاح4 وإزالة الحطام5 أثناء الإصابة أو دعم الربط الكهربائي6 في حالة مستقرة. خلال أشكال مختلفة من التهاب يحدث تدفقا هاما من Ly6Cمرحبا MHC-ثانيالو CD64int وحيدات، التي تفرق في وقت لاحق في Ly6Cمرحبا CCR2+ الضامة2،7 . عدد سكانها الخلايا المقيمين في عضلة القلب الأشخاص الأصحاء أصغر بكثير، ولكن المهم، يتكون من الخلايا الجذعية8،9. واتسمت مؤخرا المجموعات الرئيسية اثنين من وحدات تحكم المجال Dc التقليدية القلب (المؤلفان): cDC1 (CD103+ وحدات تحكم المجال Dc) و cDC2 (CD11b+ وحدات تحكم المجال Dc). وحدات تحكم المجال Dc تلعب أدواراً هامة في الدفاع ضد العدوى8 ولكن يمكن أيضا أن تعزز المتمتعة بالحكم الذاتي-الإصابة أثناء التهاب، لا سيما أثناء احتشاء عضلة القلب9.
وهنا يصف لنا طريقة بسيطة لعزل الخلايا المناعية القلب قابلة للاستمرار من الماوس عضلة القلب. الأسلوب يجمع بين الهضم الأنزيمي والميكانيكية مع خلية-مصفاة ترشيح بغية الحصول على تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها، أو كذلك تنقيته، التدفق الخلوي الفرز أو تخصيب حبة المغناطيسية. تتطلب قياسات دقيقة لخلايا عضلة القلب اكسترافاسكولار القلب نضح من أجل إزالة الملوثات المحتملة من مجرى الدم ميكروفاسكولاتوري القلب. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم خطوة اختيارية لوسم منتثر داخل الأوعية للخلايا المناعية التي يمكن استخدامها لزيادة التفرقة بين خلايا عضلة القلب من الملوثات داخل الأوعية، على أساس بروتوكول et al. البندقية10. وأخيراً، نقدم تحليل تدفق أساسية الخلوي لتحديد الفئات السكانية الفرعية بلعم ومركز السيطرة على الأمراض الرئيسية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

جهاز المناعة عنصر أساسي لصحة القلب. عضلة القلب موطن لعدد سكان الأغنياء من مجموعات فرعية مختلفة من الخلية المناعية مع التقسيم الوظيفي أثناء حالة ثابتة وأشكال مختلفة من التهاب السواء. حتى وقت قريب، دراسة الخلايا المناعية في القلب المطلوب استخدام الفحص المجهري أو تحديد بروتوكولات المتقدمة سوء الهضم، التي قدمت ما يكفي حساسية أثناء التهاب حاد ولكن لم يتمكنوا من ثقة الصغيرة – لكن الرئيسية – السكان الخلايا أثناء حالة ثابتة. هنا، نحن نناقش أسلوب بسيط الجمع الانزيمية (كولاجيناز والبروتين السكري المثبط الدناز) والهضم الميكانيكي من قلوب مورين يسبقه الإدارة داخل الأوعية المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة التفريق بين الصغيرة ولكن لا مفر منه خلية داخل الأوعية الملوثات. ينشئ هذا الأسلوب تعليق خلايا قابلة للحياة المعزولة التي يمكن تحليلها بواسطة التدفق الخلوي لتحديد الهوية، فينوتيبينج والقياس الكمي، أو تنقية كذلك مع الأسفار تنشيط الخلية فرز أو فصل حبة المغناطيسي النسخي دراسات التحليل أو في المختبر . وندرج مثال لتحليل تدفق خطوة بخطوة سيتوميتريك التفريق بين مفتاح بلعم والسكان الخلايا الجذعية للقلب. لتجربة حجم متوسط (10 قلوب) يتطلب انتهاء الإجراء ح 2 – 3.

حتى الآن، لا توجد طريقة جيدة قد صمم لعزل الخلايا المناعية من مكونات القلب خلية أخرى، مثل كارديوميوسيتيس. ومن ثم يتطلب تحليلاً لتعليق خلية مفردة القلب بالتدفق الخلوي النابضة مسبقاً مع CD45 تحديد السكان الخلايا المناعية، وتليها خلية مفردة، وصغر حجم الاستبعاد النابضة (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

عزل وتحديد الخلايا المناعية اكسترافاسكولار للقلب

ويقدم هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وفعالة عزل والتعرف على والتحديد الكمي للخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب الفئران أثناء حالة ثابتة أو التهاب. البروتوكول يجمع الهضم الأنزيمي والميكانيكية لتوليد تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها مزيد من التدفق الخلوي.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

This method can help answer key questions about the composition of immune cell subsets within the heart both during steady and disease states. The main advantage of this technique is that it can be used for accurate immunophenotyping of cardiac immune cell populations, including very rare subsets. This protocol's relatively simple.However, tail vein injections can be difficult, so it's important to practice this technique until you're comfortable before using experimental animals. To label the circulating leukocytes, load 200 microliters of freshly-prepared mouse fluorophore-conjugated anti-CD45 antibody in PBS into a 28.5-gauge insulin syringe, and prewarm eight 12-week old mice on a circulating water blanket set to 35 to 41 degrees Celsius for five to ten minutes. When the tail vein has dilated, restrain the first animal in the sternal position in an appropriate restraining device.If the tail veins are not sufficiently dilated, dip the tail in 36 to 40-degree Celsius water for one to two minutes. When the tail veins are ready swab the injection area with 70%ethanol-soaked gauze and immobilize the base of the tail with the index and middle fingers and the mid-distal region of the tail with the thumb and ring finger. Holding the needle bevel-side up and parallel to the vein, insert the needle into a dilated tail vein and intravenously inject the entire volume of antibody.Then allow the antibody to circulate for five minutes before humane euthanization. To harvest the heart, spray the mouse with 70%ethanol and lift the skin of the abdomen to open the abdomen along the ventral midline from the hips up to the sternum. Open the peritoneum and move the liver to expose the diaphragm.Cut the diaphragm and the ribs on both sides of the midline, taking care to avoid puncturing the lungs and heart. Peel back the ribs to expose the heart before incising the left and right atria. Gently grasping the base of the heart with forceps, insert a 21-gauge needle attached to a 60-milliliter syringe into the left ventricle near the apex and perfuse the heart with 15 to 20 milliliters of cold PBS.Proper perfusion of the heart is essential to avoid intravascular contaminants. Therefore take care to dissect and perfuse the heart quickly after euthanasia to avoid contamination to due to coagulated blood. After perfusing the right ventricle as just demonstrated, white lungs and a pale liver should be observed.Holding the base of the heart with the forceps gently pull the heart up and cut the major pulmonary arteries and veins, aorta and pericardial sac to detach the cardiac tissue. Gently holding the heart between the thumb and index fingers carefully clean heart with a clean lint-free paper towel and use the forceps to remove the atria and any remnants of any major arteries and veins or other contaminants. Place the cleaned heart in a five-centimeter plastic dish and add 50 microliters of cold PBS.Using curved dissecting scissors mince the heart until there are no visible pieces and the tissue has a smooth thick consistency. Use curved forceps to transfer the tissue into two-milliliter microcentrifuge tubes containing 800 microliters of cold DMEM. Supplement with collagenase, DNase, and hyaluronidase and incubate for 45 to 60 minutes at 37 degrees Celsius and 50 rpm.At the end of the digestion vortex samples for 20 seconds and immediately place them on ice. The sample should always be kept at four degrees Celsius unless otherwise specified as some surface antigens can be internalized if left at room temperature. Then pre-wet 140-microliter cell strainer in a 50-milliliter conical tube per sample with one milliliter of cold HBB.Using a one-milliliter pipette, pipette the samples until the tissue suspensions are homogenous and do not clog the pipette tip and add the homogenized samples to the filters. Slowly wash the samples through the filters with 12 to 14 milliliters of cold HBB per sample, and transfer the filtered samples to a labeled 15-milliliter conical tube on ice. A good digestion is demonstrated by the absence of heart remains in the filter.Collect the samples by centrifugation and remove the supernatant. Add one milliliter of ammonium chloride potassium lysis buffer to each sample. Resuspend the samples with brief vortexing, followed by a five-minute incubation at room temperature.Then stop the hemolysis with five to eight milliliters of cold HBSS. Collect the samples by centrifugation and resuspend the pellets in one milliliter of fluorescence-activated cell sorting or FACS buffer and transfer to individual 1.5-milliliter microcentrifuge tubes for another centrifugation. To analyze the samples by flow cytometry resuspend the pellets in 50 microliters of anti-CD16/CD32 antibody and a monocyte blocker to reduce the nonspecific antibody binding for a 15-minute incubation at room temperature.Without washing, add 50 microliters of antibody master mix to each sample with mixing for a 30-minute incubation at four degrees Celsius protected from light. At the end of the incubation, wash the samples with 600 microliters of FACS buffer per tube and resuspend the pellets in 300 microliters of fresh FACS buffer or 1%paraformaldehyde. Then analyze the cardiac leukocytes by flow cytometry according to standard flow analysis protocols.Analysis of the cardiac single cell suspension by flow cytometry requires pre-gating with CD45 to differentiate immune cells from nonimmune cells of the heart, followed by single cell and small size exclusion gating. Macrophages, identified by their CD64 expression, are the major immune cell population of the heart, representing 60 to 70%of all immune cells. Conventional cardiac dendritic cells are CD64-negative cells that express high levels of MHC class II and CD11c.These cells can be further divided based on their expression of either CD103 or CD11b and represent a much smaller cardiac subpopulation compared to macrophages. The use of flow cytometry of a single cell suspension of myocardium allows the study of small leukocyte subpopulations within the heart. For example, using flow cytometry analysis to compare the immune cells of the myocardium of wild type versus Batf3-deficient mice, the lack of CD103-positive dendritic cells can be confirmed within the knockout animals.In addition, this analysis revealed a lack of significant alteration of the composition of other cardiac populations in the Batf3-deficient animals, demonstrating the degree of sensitivity that can be achieved using this combined method of enzymatic and mechanical digestion to achieve a single cell suspension. While attempting this procedure, it's important to always take into account the viability of your cell isolate. Therefore we recommend optimizing the time and enzyme concentration of the digestion according to your experimental conditions.Following this procedure, other methods, such as single cell RNA sequencing, functional assays, and magnetic bead isolation can be performed to answer additional questions about the functions of the isolated cells.