Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Studere regulering av efferocytosis krever metoder som er nøyaktig kvantifisere opptaket av apoptotisk celler og undersøke signalnettverk og cellulær prosessene som styrer efferocytosis. Denne kvantifisering kan være vanskelig å utføre apoptotisk celler er ofte efferocytosed stykkevis, dermed nødvendiggjør metoder som kan nøyaktig avgrense mellom den efferocytosed delen av en apoptotisk mål mot gjenværende unengulfed mobilnettet fragmenter. Tilnærmingen skissert heri utnytter dual-merking tilnærminger til å tallfeste nøyaktig dynamikken i efferocytosis og efferocytic antall efferocytes som makrofager. Stoffer til apoptotisk-cellen er merket med en celle-sporing fargestoff aktivere overvåking av alle apoptotisk celle-avledet materiale, mens overflaten biotinylation apoptotisk cellen tillater differensiering mellom internalisert og ikke-internalisert apoptotisk celle fraksjoner. Efferocytic kapasitet på efferocytes bestemmes av tar fluorescerende bilder av live eller fast celler og kvantifisere mengden bundet versus internalisert mål, som atskilte av streptavidin flekker. Denne tilnærmingen gir flere fordeler sammenlignet med metoder som flowcytometri, nemlig nøyaktig avgrensning av ikke-efferocytosed mot efferocytosed apoptotisk celle fraksjoner, muligheten til å måle efferocytic dynamics live-celle mikroskopi, og kapasitet til å utføre studier av mobilnettet signalering i celler som uttrykker fluorescently-merket effekter av transgener. Kombinert, tjene metodene som er nevnt i denne protokollen som grunnlag for en fleksibel eksperimentelle tilnærming som kan brukes til nøyaktig kvantifisere efferocytic aktivitet og undersøke mobilnettet signalveier aktive under efferocytosis.