Cuantificación de proteínas solubles de la planta y Digestible contenido de hidratos de carbono, utilizando el maíz (Zea mays) como un ejemplar

Resumen

Los protocolos descritos proporcionan una metodología clara y accesible para la medición de proteína soluble y digestible carbohidratos (no estructurales) contenido en los tejidos vegetales. La capacidad de cuantificar estos macronutrientes de dos plantas tiene implicaciones importantes para el avance de los campos de la fisiología vegetal, ecología nutricional, interacciones planta-herbívoro y ecología trófica.

Resumen

Datos elementales se utilizan para inferir la calidad de la planta como un recurso para herbívoros. Sin embargo, la ubicuidad de carbono en biomoléculas, la presencia de compuestos defensivos de plantas que contienen nitrógeno y la variación en sobre correlaciones entre el contenido de proteínas nitrógeno y planta todos limitan la exactitud de estas inferencias. Además, la investigación centrado en planta y/o fisiología de herbívoros requieren un nivel de precisión que se consigue no utilizando generalizado correlaciones. Los métodos presentados aquí ofrecen a los investigadores un protocolo claro y rápido para medir directamente la planta de proteínas solubles y digeribles carbohidratos, los macronutrientes de dos plantas más estrechamente vinculados al funcionamiento fisiológico animal. Los protocolos combinan ensayos colorimétricos bien caracterizados con pasos de digestión específica planta optimizada para proporcionar resultados precisos y reproducibles. Nuestros análisis de maíz diferentes tejidos muestran que estos ensayos tienen la sensibilidad para detectar variación en plantas soluble de la proteína y el contenido de carbohidratos digeribles en múltiples escalas espaciales. Estos incluyen las diferencias entre la planta en crecimiento de regiones y especies o variedades, así como diferencias en el tipo de tejido y diferencias posicionales incluso dentro del mismo tejido dentro de la planta. La combinación de contenido de carbohidratos digeribles y proteína soluble con datos elementales también tiene el potencial para proporcionar nuevas oportunidades en biología vegetal para conectar la nutrición mineral de las plantas con procesos fisiológicos de la planta. Estos análisis también ayudan a generar la proteína soluble y los datos de carbohidratos digestibles necesarios para estudiar ecología nutricional, interacciones planta-herbívoro y dinámica trófica, que a su vez mejorará la fisiología y la investigación ecológica.

Introducción

Biomasa vegetal constituye la base de virtualmente todos tróficas terrestres. Las plantas adquieren elementos nutritivos del suelo a través de sus sistemas de raíces y utilizan luz del sol en sus tejidos foliares para sintetizar biomoléculas. En particular, carbono y nitrógeno se utilizan para crear los hidratos de carbono, las proteínas (formadas por los aminoácidos), y lípidos que son necesarios para construcción biomasa vegetal (cabe señalar que en la planta fisiología que los "macronutrientes" de término a menudo se refiere a los elementos del suelo, tales como N, P, K y S, sin embargo, a lo largo de este trabajo este término se refieren a biomoléculas, como proteínas, carbohidratos y lípidos). Cuando los herbívoros consumen material vegetal, los macronutrientes contenidos en los tejidos vegetales son desglosadas en sus partes constituyentes y entonces utilizados para conducir los procesos fisiológicos de los consumidores. De esta manera, macronutrientes de la planta tienen una fuerte influencia en la fisiología del consumidor junto con implicaciones importantes para las interacciones ecológicas de mayor orden y dinámica trófica.

En todo el reino animal, proteína soluble y digestibles carbohidratos son macronutrientes más ligadas a la supervivencia, reproducción y rendimiento¹. Por otra parte, la mayoría de los animales regula activamente la ingesta de estos dos macronutrientes para satisfacer sus demandas fisiológicas^1,2. Esto es particularmente cierto para los insectos herbívoros que detectan las concentraciones de azúcares y aminoácidos en los tejidos vegetales, que a su vez dirige el comportamiento de alimentación. Como resultado, la planta soluble de la proteína y contenido de carbohidratos digeribles ha jugado un fuerte papel en la evolución de las interacciones planta-insecto.

Mientras que datos de la proteína soluble de planta y contenido de carbohidratos digeribles son relativamente raros (pero véase^{6,7,8,9,10,11}), hay una preponderancia de datos disponibles sobre el contenido elemental de la planta (carbono, nitrógeno y fósforo). En gran parte esto es porque los elementos desempeñan un papel primario en planta nutrición mineral^3,4,5. Donde se miden los elementos, las correlaciones se han utilizado para extrapolar la cantidad de proteína soluble y digestible carbohidratos, pero cálculos exactos a menudo son difíciles de obtener. Por ejemplo, es imposible utilizar el carbono como un indicador del contenido de carbohidratos digestibles de la planta porque el carbón es ubicuo presente en todos los compuestos orgánicos. Existe una relación más fuerte entre el contenido de proteína soluble de planta y nitrógeno elemental, y a menudo se utilizan factores de conversión de nitrógeno a proteína generalizadas. Sin embargo, existe fuerte evidencia que la conversión de nitrógeno a proteína es altamente específicos^12,13,14,15, aprovechando la conversión generalizada probable inexactos. Debido a esto, factores de conversión de nitrógeno a proteína a menudo carecen de precisión, especialmente en la medida en que se requiere para estudios nutricionales sobre los herbívoros. Además, la presencia de aleloquímicos de plantas que contiene N, tales como alcaloides y glucosinolatos que a menudo son tóxicos para los herbívoros, puede confundir estas conversiones.

Aquí, ofrecemos dos análisis químicos para la medición de la concentración de proteínas solubles y digeribles carbohidratos en los tejidos vegetales. Estos ensayos se presentan por separado, pero se sugiere que se utilizaban simultáneamente analizar las mismas muestras de la planta para lograr un análisis más exhaustivo de macronutrientes de la planta. Ambos emplean metodologías similares, que consiste en un paso de extracción, seguido por la cuantificación por absorbancia. Planta preparación de muestra también es idéntico para ambos protocolos, lo que facilita realizar ambos análisis en tándem. La utilidad de estos ensayos no se derivan de su novedad, ya que dependen de viejo, (Bradford, Jones, Dubois) ensayos colorimétricos establecidos^16,17,18, pero aquí hemos organizado un claro y fácil de seguir Protocolo que combina estos métodos con más oscuras técnicas de extracción específica de planta^17,19 para hacer más accesible a los campos correspondientes a la planta de la aplicación de estos ensayos.

Para ambos ensayos, macronutrientes de la planta se extraen primero físicamente por congelación 1.llenar y moler material vegetal. Para el análisis de la proteína soluble, más extracción química se hace^17,19 a través de varias rondas de Vortex y calentar las muestras en solución de NaOH. El conocido ensayo de Bradford, utilizando G-250 azul brillante de Coomassie, se utiliza para cuantificar proteínas solubles y polipéptidos entre 3.000-5.000 Daltons^16,17. Este ensayo tiene un rango de detección entre 1-20 μg de proteínas totales por microplacas bien o < 25 μg/mL, pero no no medida amino ácidos. El paso de extracción de la prueba de carbohidratos digeribles se basa en el método ácido diluido de Smith et al. ²⁰ y permite el aislamiento de azúcares solubles, almidón y fructosan – pero carbohidratos no estructurales. Un método de cuantificación de ácido fenol-sulfúrico procede de Dubois et al. ¹⁸ y mide todo mono-, oligo- y polisacáridos (así como derivados de metil). Este ensayo es capaz de cuantificar azúcares específicas, pero aquí utiliza como un indicador del contenido total de carbohidrato digestible (ver Smith et al. ²⁰ para un análisis más detallado). Juntos, estos análisis miden los dos macronutrientes que se atan fuertemente para planta ecofisiología y herbívoro el rendimiento, proporcionar datos importantes sobre la calidad del recurso en la base de tróficas terrestres. Presentación de estos protocolos promueve la generación de conjuntos de datos de planta macronutrientes con el fin de obtener una comprensión más profunda de la fisiología vegetal, ecología nutricional de herbívoros e interacciones planta-herbívoro.

Protocolo

1. recogida y tratamiento de la planta

1. Recoger y procesar muestras de planta
   1. Después de recoger muestras de plantas, flash congelar muestras de material vegetal de inmersión en nitrógeno líquido con pinzas y conservar a-80 ° C. Si las muestras de plantas recolectadas son demasiado grandes para flash-freeze, enfriar rápidamente las muestras con hielo seco y la transferencia a un congelador de-80 ° C tan pronto como sea posible. El contenido de macronutrientes de material vegetal puede cambiar después de que los tejidos están separados de la planta, por lo que es importante congelar las muestras de la planta tan pronto como sea posible después de la colección.
      PRECAUCIÓN: Nitrógeno líquido puede causar quemaduras graves al contacto con la piel. Por favor, asegúrese de que para el transporte de nitrógeno líquido en recipientes homologados y use PPE adecuado durante su manejo, incluyendo crio-guantes, gafas de ojo, visera, delantal y una capa del laboratorio.
   2. Liofilizar material vegetal utilizando a un secador de congelación para asegurar que los tejidos metabólicamente inactivos mientras que extrae el agua. Seco hasta que la masa de la muestra se estabilice para toda el agua se ha eliminado.
   3. Una vez las muestras estén secas, moler en un polvo fino usando un molinillo o molino. Almacenar las muestras en un desecante gabinete hasta su análisis.

2. solubilidad de la proteína análisis

1. Preparación de la muestra
   1. Pesar muestras replicadas de cada tejido, aproximadamente 20 mg cada una, en tubos de poliestireno de microcentrífuga de 1,5 mL y tubos de etiqueta. Estas muestras serán posteriormente se denomina muestras desconocidas. Se registra la masa exacta de cada muestra, como se necesitará esta información para calcular el % de proteína soluble en cada muestra desconocida. Utilizar tubos de microcentrífuga con tapas de cierre, como las tapas no se pueden abrir durante la etapa de calefacción posterior, resultando en pérdida de solución de la muestra.
2. Solubilizar y aislar las proteínas de la muestra desconocida
   1. Utilizando una micro pipeta, Añadir 500 μl de 0,1 M NaOH a cada tubo. Cierre bien las tapas y someter a ultrasonidos durante 30 minutos. Precalentar el agua caliente baño 90 ° C.
      PRECAUCIÓN: Hidróxido de sodio es una base fuerte y puede causar quemaduras al contacto con la piel. Aunque 0,1 M NaOH representa una baja concentración, utilice guantes para evitar irritación de la piel.
   2. Colocar tubos en una parrilla en el baño de agua caliente durante 15 minutos.
   3. Centrifugar los tubos a 15.000 x g durante 10 minutos. Pipeta el líquido sobrenadante en tubos de microcentrífuga etiquetado nuevo, utilizando una nueva pipeta para cada muestra. Añadir 300 μL de 0,1 M NaOH en el tubo que contiene el pellet y centrifugar nuevamente a 15.000 x g durante 10 minutos. Una vez más, recoger el líquido sobrenadante y combinarla con el otro líquido sobrenadante de la misma muestra. Este es un potencial punto de parada, y las muestras pueden almacenarse a 4 ° C durante la noche si es necesario.
3. Precipitar proteínas vegetales
   1. Neutralizar el pH de la solución sobrenadante mediante la adición de 11 μl de 5,8 M HCl. confirmar un pH de ~ 7 sumergiendo el papel de tornasol en cada solución de la muestra.
      PRECAUCIÓN: Ácido clorhídrico es un ácido fuerte y corrosivo que puede causar quemaduras al contacto con la piel (aplicación de piel o inhalación). Favor de utilizar guantes para evitar irritación de la piel durante la manipulación de ácido clorhídrico.
   2. Agregar 90 μl del 100% el ácido tricloroacético (TCA) a cada tubo e Incube los tubos en hielo durante 30 minutos. La precipitación de las proteínas cambia la solución de transparente a opaco. Si esto no ocurre después de 30 minutos, refrigerar los tubos durante 1 hora. Este es un potencial punto de parada, y las muestras pueden almacenarse a 4 ° C durante la noche si es necesario.
      PRECAUCIÓN: El ácido tricloroacético es corrosivo. Favor de utilizar guantes al manipular para evitar el contacto con la piel y evitar la inhalación.
   3. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Retire con cuidado el TCA sobrenadante por succión utilizando una línea de vacío conectada a una punta de una micropipeta de vidrio fino (la punta del mismo puede ser utilizada a través de las muestras). No molestar el precipitado de proteína evitando aspiración fuerte y manteniendo una distancia apropiada entre la punta de la pipeta y el pellets.
   4. Lavar el pellet con 100 μl de acetona de-20 ° C. Este paso elimina cualquier resto TCA de la pelotilla, que puede interferir con el posterior ensayo de Bradford; sin embargo, acetona comenzará a disolver el precipitado de proteína si se dejan en contacto mucho tiempo, por lo que la acetona se debe agregar rápidamente extraído de la pelotilla en 5 segundos.
   5. Permitir que la acetona se evapore por colocación de tubos en una campana de humos o el refrigerador. Luego, disolver el precipitado de proteína mediante la adición de 1 mL de 0,1 M NaOH a cada tubo. Disolver completamente la pastilla puede requerir varias rondas de calefacción de agua caliente baño, Vortex y sonicando.
      Nota: Cuanto más tiempo los tubos permanecen en la campana o refrigerador y el secador los pellets llegan, más difícil será volver a solubilizar. Se recomienda secar el pellet por 30 minutos, y luego busque la presencia de acetona cada 10-15 minutos hasta que esté claro que la acetona se evapore (vapores de acetona no son detectables).
4. Mezcla de soluciones estándar, muestra desconocida soluciones diluidas y cuantificar el contenido de proteína total de muestras desconocidas usando el ensayo de Bradford.
   1. Preparar la inmunoglobulina bovina soluciones estándar G (IgG) según las concentraciones que figuran en la tabla 1 (liofilizado o solución madre IgG se puede mezclar con agua desionizada para lograr cada concentración). Normas de almacén a 4 ° C. En una placa de 96 pocillos, agregar 160 μl de cada solución estándar de IgG en triplicado a partir de la posición A1 de la placa de la pozo (0 μg/μl en A1, A2, A3 posición, 0,0125 μg/μl en B1, B2, B3 posiciones, etc.).
   2. Preparar una solución de NaOH diluida mediante la adición de 50 μl de 0,1 M NaOH a 950 μl de agua destilada. Como control negativo en blanco, añadir 60 μL de esta solución a la placa bien por triplicado (G1, G2, G3 posiciones).
   3. Preparar diluciones de muestras desconocidas por añadiendo 50 μl de cada solución de muestra a 950 μl de agua destilada en un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL. Luego, añadir 60 μL de cada muestra diluida a la placa bien por triplicado, a partir de la posición H1. Una placa de 96 pocillos debe permitir el análisis de los estándares de 6, 1 espacio en blanco y 25 muestras desconocidas cuando se lee por triplicado. Cada placa bien analizado debe contener sus propia IgG las muestras estándar y en blanco.
   4. Añada 100 μl de agua destilada en todos los pocillos de las muestras en blanco y desconocidos. Ahora bien cada uno debe contener un total de 160 μl. usando una pipeta multicanal (8 canales), agregar 40 μl de proteína de G-250 de azul brillante de Coomassie tinte a todo bien en la primera columna de la placa de la pozo. Mezclar el tinte con las muestras hundiendo varias veces. Repita para todas las otras columnas, reemplazo de puntas de pipeta para evitar la contaminación.
      PRECAUCIÓN: G-250 azul brillante de Coomassie es un irritante y contacto con la piel, ojos o pulmones deben evitarse. Favor de utilizar guantes para evitar contacto con la piel. Si se produce contacto con la piel, este producto se mancha.
   5. Utilice una aguja para las burbujas presentes en los pozos, ya que pueden interferir con la lectura del espectrofotómetro de microplacas. Limpie la aguja para evitar la contaminación entre pozos. Deje que la microplaca a incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   6. Utilizando un espectrofotómetro de microplacas, registrar los valores de absorbancia de cada pocillo a 595 nm.
   7. Registre la absorbancia promedio para los tres pocillos del blanco y restar este valor de cada una de las lecturas de la muestra estándar y desconocido. A continuación, registre la absorbancia promedio para cada muestra de estándar y desconocido.
      Nota: Para calcular la cantidad de proteína presente en cada muestra desconocida usando la curva estándar, lo más fácil es retroceder la absorbencia media de cada estándar frente a los microgramos de proteína presente en cada norma, pero uno puede representar la concentración de proteína (μ g/μL) de cada estándar si deseable. Los siguientes cálculos, sin embargo, refieren a una curva estándar basada en microgramos, no concentraciones (μg/μl).
   8. Represente la absorbancia promedio de cada estándar frente a la cantidad total de proteína presente en cada uno bien del estándar (tabla 1). Coloque una línea de regresión lineal de estos datos y utilizar la ecuación para calcular la cantidad de proteína (μg) en cada muestra desconocida bien basado en la absorbancia promedio (Figura 1a).
      Nota: El coeficiente de correlación (valorr ) de esta línea debe ser mayor de 0.98 y rutinariamente cerca de 0.99. La regresión estándar será específica para cada plato, por lo tanto los pozos de muestra desconocida en cada plato deben ser analizados por separado.
   9. Una vez que la cantidad promedio de proteína se calcula para cada pocillo de la muestra desconocida, utilice la siguiente ecuación para calcular la cantidad total de proteína (μg) en cada muestra original:
      M_p = (((con_p60) x 1000) / 50) * 1000
      M_p = μg de proteína en la muestra original
      W_p = μg de proteína en la muestra desconocida bien
      1. A continuación, utilizar la siguiente ecuación para determinar el porcentaje de proteína en cada muestra:
         P_p = ((M_p/1000) /M_i) * 100
         P_p = % de proteína en la muestra
         M = masa inicial de la muestra (mg)
         Nota: En algunos casos, la muestra puede superar el umbral de la absorbencia superior. Si es así, las soluciones muestra pueden necesitan diluirse en paso 2.4.3.
         Diluciones adicionales deben entonces explicarse en cálculos posteriores. Algunas marcas de lector de microplacas disponen de software de computadora que calculará automáticamente la concentración de proteína promedio de cada muestra desconocida basándose en los datos de la curva estándar.

3. digestión de hidratos de carbono ensayo

1. Preparación de la muestra
   1. Pesar muestras replicadas de cada tejido, aproximadamente 20 mg cada una, en vidrio de tubos de 15 mL con tapones de goma-alineado (100 mm de longitud). Estas muestras serán posteriormente denominará muestras desconocidas. Etiqueta los tubos con un marcador impermeable o con etiquetado de cintas en los párpados y la masa exacta de cada muestra, se registra como esta información se necesitará para calcular el % de carbohidratos en cada muestra desconocida.
2. Extraer los carbohidratos digeribles de cada muestra desconocida.
   1. Añadir 1 mL de 0.1 M H₂para que₄ a cada tubo y tapones en fuertemente los tubos. Colocar en un baño de agua hirviendo durante 1 hora.
      PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico es muy corrosivo. Por favor, use guantes, gafas de ojo y un delantal cuando maneje H₂hasta₄ y realizar este paso en una campana de humos.
   2. Enfriar los tubos en un baño de agua tibia. Vierta el contenido del tubo en etiquetado 1,5 mL tubos de microcentrífuga (no se preocupe si algunos restos materiales de plantas en los tubos de vidrio).
   3. Centrifugar los tubos a 15.000 x g durante 10 minutos. Retire el líquido con una micro pipeta y en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetado. Los tubos se pueden refrigerar durante la noche en este punto. Si continuando con el análisis, consulte el paso 3.3.2.
3. Mezcla de soluciones estándar y cuantificar el contenido de carbohidratos digeribles totales de muestras desconocidas.
   1. Preparar D(+) glucosa soluciones con las concentraciones listadas en la tabla 2. Preparar seis tubos de ensayo de vidrio con 400 μL de cada solución estándar.
   2. Pipetear 15 μl de cada muestra desconocida en su propio tubo de ensayo y añadir 385 μl de agua destilada a cada uno para un volumen total de 400 μL en cada tubo de ensayo. En una campana de humos, añadir 400 μL de fenol 5% a cada tubo de ensayo de la muestra estándar y desconocido, y luego rápidamente pipetear 2 mL de concentrado de H₂SO₄ en cada tubo. No tocar el contenido del tubo de ensayo con la punta de la pipeta, sólo tiene que añadir a la superficie de la solución (una pipeta repetidor funciona mejor para esto).
   3. Dejar tubos incubar durante 10 minutos y luego cuidadosamente vórtex los tubos para mezclar el contenido. Incubar durante 30 minutos.
      PRECAUCIÓN: Fenol y ácido sulfúrico son corrosivos irritantes. Para proteger de la exposición a la piel, ojos e inhalación, este paso debe realizarse en una campana de humos químicos utilizando el EPI adecuado, que incluye: frente escudo u ojo gafas, guantes de goma, delantal de laboratorio y botas. Mezcla fenol con el ácido sulfúrico también resulta en una reacción exotérmica, que dará como resultado los tubos en caliente.
   4. Pipetear 800 μl de la muestra de cada tubo en cada uno de 3 cubetas semi-micro poliestireno 1.5ml (3 repeticiones técnicas por ejemplo). Ajustar el espectrofotómetro para leer a 490 nm. Calibrar a una cubeta en blanco con agua destilada antes de leer las normas o muestras desconocidas e intermitentemente a lo largo de las lecturas de la muestra. Recorren cada cubeta de espectrofotómetro y registre la absorbancia. Media a través de técnicas Replica para cada muestra desconocida.
      Nota: En algunos casos, las muestras pueden superar el umbral de la absorbencia superior. Si es así, las muestras deben diluirse en el paso 3.2.3. Diluciones deben también ser tratadas contablemente en posteriores cálculos.
   5. Calcular la absorbancia promedio para cada estándar.
      Nota: Para calcular la cantidad de carbohidratos digestibles totales presentes en cada muestra desconocida usando la curva estándar, lo más fácil es retroceder la absorbencia media de cada estándar frente a los microgramos de glucosa D (+) presente en cada nivel, pero uno puede también representar la concentración de glucosa D (+) (μg/μl) de cada estándar si deseable. Los siguientes cálculos, sin embargo, refieren a una curva estándar basada en microgramos, no concentraciones (μg/μl).
   6. Calcular la curva estándar mediante la representación de la absorbancia media contra la cantidad total de glucosa D (+) (μg) en cada solución estándar. Montar una línea de regresión lineal de estos datos y luego utilizar la siguiente ecuación para calcular la cantidad total de hidratos de carbono (μg) en cada muestra desconocida:
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15)) * 1000
      M_c = μg de hidratos de carbono en la muestra
      A_x = absorbancia media de muestra desconocida
      b = intersección (línea de regresión estándar)
      m = pendiente (línea de regresión estándar)
      El coeficiente de correlación de esta línea debe ser mayor de 0.98 y rutinariamente cerca de 0.99. A continuación, utilizar la siguiente ecuación para determinar el porcentaje de carbohidratos en cada muestra:
      P_c = ((M_c/1000) / (M_i)) * 100
      P_c = % de carbohidratos
      M = masa inicial de la muestra (mg)

Resultados

Para mostrar la utilidad de estos métodos, hemos analizado el soluble de la proteína y el contenido de carbohidratos digeribles de cuatro diverso campo y tejidos de maíz que sirven como recursos nutricionales potenciales distintos para los insectos herbívoros. Recogimos a mazorcas de maíz de tres regiones agrícolas en los Estados Unidos (Minnesota, Carolina del norte y Texas), que abarca cinco variedades de maíz dulce (es decir, genotipos) y una variedad de maíz de campo ...

Discusión

Mediante la combinación de ensayos colorimétricos establecidos con los protocolos de extracción específica de planta efectiva, los ensayos demostrados aquí proporcionan un método razonable y exacto para la medición de proteínas solubles de la planta y contenido de carbohidratos digeribles. Nuestros resultados usando maíz como exemplar ilustra cómo estos protocolos pueden utilizarse para obtener mediciones precisas a través de diferentes escalas espaciales biológicamente relevantes. Por ejemplo, hemos sido cap...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
microplate reader (spectrophotometer)	Bio-Rad	Model 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate	Bio-Rad	#5000006	450mL