ومولت الدراسة (منح و-Q. Z.) من المعاهد الوطنية للصحة (R01NS064288، R01NS085176، R01GM111514، R01EY027347) ومؤسسة نيلسون H. كريغ ومؤسسة برايتفوكوس.

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكول الحيوانية وافقت عليها لجنة الاستخدام وجونز هوبكنز رعاية الحيوان المؤسسية.
1-المواد والكواشف
<ol><li>
الحيوانات
	<ol>
<li>استخدام عمرها ست الأسبوع الإناث CF1 الفئران وزنها 30 – 35 ز للتجارب. ملاحظة: الفئران تم إيواء المجموعة ...

<ol>
	<li>Saijilafu, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1.">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690 (2013).</li><li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration.">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li><li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression.">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1865 (2015).</li><li>Krames, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+dorsal+root+ganglion+in+the+development+of+neuropathic+pain.">The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain.</a> Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).</li><li>Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+transfection+methods+optimized+for+gene+delivery+to+a+lung+cancer+cell+line.">Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).</li><li>Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+2017:+Progress+and+Future+Directions.">Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions.</a> Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).</li><li>Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Transfer+into+Mouse+Lyoma+Cells+by+Electroporation+in+High+Electric-Fields.">Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields.</a> The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-138+and+SIRT1+form+a+mutual+negative+feedback+loop+to+regulate+mammalian+axon+regeneration.">MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nature Communications. 2, 543 (2011).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13, 859 (2016).</li><li>Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterolateral+intertransverse+lumbar+fusion+in+a+mouse+model:+surgical+anatomy+and+operative+technique.">Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique.</a> Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).</li><li>Dommisse, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+supply+of+the+spinal+cord.+A+critical+vascular+zone+in+spinal+surgery.">The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).</li><li>Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice.">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li></ol>

العديد من الخطوات الجراحية تتطلب اهتماما خاصا. L4 و L5 باﻷسعار (موقع حسام)، التي تهيمن على العصب الوركي، تحتاج إلى تحديد بشكل صحيح وحقن بنيات الجينات. خلاف ذلك، ستكون غائبة التجارة والنقل-وضع العلامات في العصب الوركي محاور عصبية. يمكن اعتبار القمم حرقفي المعالم التشريحية مفيدة لتحديد L4 و L5 ب...

إصابات في الجهاز العصبي الناجم عن الصدمات العصبية أو أمراض الأعصاب المختلفة عادة ما تسفر عن العيوب في الوظائف الحركية والحسية والإدراكية. مؤخرا، قد كرس الكثير من الجهد لإعادة إنشاء قوتها التجدد في الخلايا العصبية الكبار لاستعادة الخلايا العصبية الفسيولوجية فونكتيونسوف أصيب1،2،3. الخلايا العصبية الحسية في الرسم هي مجموعة من الخلايا العصبية التي تنقل المنبهات الحسية المختلفة، مثل الألم، ودرجة الحرارة، واللمس، أو موقف الهيئة، إلى الدماغ. كل من هذه الخلايا العصبية الزائفة القطب الواحد ويحتوي على إكسون وحيدة التي إلى فرع واحد يمتد باتجاه المحيط وفرع أخرى تتجه نحو النخاع الشوكي4. من الخلايا العصبية الحسية الكبار في باﻷسعار بين الخلايا العصبية الثدييات ناضجة قليلة معروفة لتجديد على محاور عصبية بنشاط بعد الإصابة. ومن ثم الإصابات من محاور عصبية حسية على نطاق واسع استخدمت كنموذج بالغ الأهمية لدراسة آليات التجديد محواري في فيفو.
في فيفو تقنيات تعداء الجينات، وعادة ما تكون أقل استهلاكاً للوقت لإعداد وأكثر مرونة من استخدام الحيوانات المحورة وراثيا، لعب أدوار أساسية في دراسة وظائف الجينات وإشارات المسارات في الجهاز العصبي. ويمكن تصنيف التقنيات الرئيسية في نهجين اثنين: الفيروسات المستندة إلى صك و5. يمكن أن توفر على أساس الفيروسية في فيفو إيصال الجينات في الخلايا العصبية الكبار دقيقة التلاعب الزمانية المكانية ل التعبير الجيني6. ومع ذلك، تشارك عمليات كثيفة العمالة في الأساليب المستندة إلى الفيروسية، مثل إنتاج وتنقية الجزيئات الفيروسية التي تحتوي على الجين المطلوب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنشيط العديد من النواقل الفيروسية المناعي للبلد المضيف، والتي قد تتداخل مع الحصول على البيانات، تحليل البيانات، وربما تضليل تفسير النتائج التجريبية. يستخدم انهانسر، نهجاً تعداء المستندة إلى صك نموذجي، نبض كهربائية لزيادة نفاذية الخلية والأغشية النووية عابر، التي تفضل تدفق الجينات الناقلة أو الصغيرة رنا أوليجوس من الفضاء خارج الخلايا7 . في المختبر انهانسر المسلم به على نطاق واسع كاستراتيجية عابرة ولكنها ذات كفاءة عالية للتلاعب بالجينات المستهدفة في العديد من أنواع الخلايا. على الرغم من أن في فيفو انهانسر لا يؤدي إلا إلى التعبير الجيني عابر مع انخفاض كفاءة ترانسفيكتينج مقارنة بالنواقل الفيروسية، له مزايا مختلفة عبر نهج الفيروسية. على سبيل المثال، فإنه يمكن تطبيقها على تقريبا جميع الأنسجة والخلايا7،،من89. وباﻹضافة إلى ذلك، أما والبلازميدات ترميز الجينات في المصالح أو صغيرة أوليجوس الحمض النووي الريبي (مثلاً، سيرناس، ميكرورناس) ضد بعض النصوص يمكن حقنها في الأنسجة المستهدفة مباشرة وثم كهربائياً نابض، الذي جعل الإجراء العمل أقل-و الوقت المستهلكة. وعلاوة على ذلك، من الممكن ترانسفيكتينج والبلازميدات والجيش الملكي النيبالي أوليجوس في أن واحد مع انهانسر واحدة متعددة.
وقد أنشأنا في فيفو نهج انهانسر للتلاعب بالجينات في الخلايا العصبية الحسية الماوس الكبار وتطبيقها بنجاح والتحقق من صحة هذا النهج في عدة دراسات رائدة1،2،3 ،،من810. نقدم هنا، بروتوكول مفصلة لتسهيل استخدام هذا النهج للدراسات المستقبلية للتجدد إكسون الثدييات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1039px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">ECM 830 Square wave electroporation system</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0052</td>
			<td style="width:351px;">For in vivo electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">Tweezertrodes electrodes</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0524</td>
			<td>For in vivo electroporation, 1 mm flat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:232px;">Parker Instrumentation</td>
			<td style="width:121px;">1096</td>
			<td>Intracellular Microinjection Dispense Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary Puller</td>
			<td style="width:232px;">NARISHIGE</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">1902328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Stereo Dissection Microscope</td>
			<td style="width:232px;">Leica</td>
			<td style="width:121px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Rongeur</td>
			<td style="width:232px;">F.S.T</td>
			<td style="width:121px;">16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Forceps</td>
			<td style="width:232px;">FST by DUMONT, Switzerland</td>
			<td style="width:121px;">11255-20</td>
			<td>Only for sciatic nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:232px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">TW100-4</td>
			<td>10 cm, standard wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tape</td>
			<td style="width:232px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:121px;">15-901-30</td>
			<td>For fixing the mouse on the corkboard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">T48402</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">152463</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">SIC003</td>
			<td>Non-target siRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:335px;">microRNA Mimic Transfection Control with Dy547</td>
			<td style="width:232px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:121px;">CP-004500-01-05</td>
			<td>Non-target microRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmids preparation kit</td>
			<td style="width:232px;">Invitrogen Purelink</td>
			<td style="width:121px;">K210016</td>
			<td>GFP-coding plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fast Green Dye</td>
			<td style="width:232px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F7252</td>
			<td>For better visualization of the DRG outline during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Ketamine</td>
			<td style="width:232px;">Putney, Inc</td>
			<td style="width:121px;">NDC 26637-731-51</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Xylazine</td>
			<td style="width:232px;">AnaSed</td>
			<td style="width:121px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Acetaminophen</td>
			<td style="width:232px;">McNeil Consumer Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">NDC 50580-449-36</td>
			<td>Post-surgical pain relief</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion

انهانسر نهج تعداء جينات غير فيروسية أساسية لإدخال والبلازميدات الحمض النووي أو جزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة في الخلايا. العصبية حسية في العقدة الظهرية الجذرية (باﻷسعار) يمتد من إكسون واحدة بفرعين. فرع واحد يذهب إلى الطرفية العصبية (فرع الطرفية)، والفرع الآخر يدخل الحبل الشوكي من خلال الجذر الظهرية (فرع الوسطى). فرع الأجهزة الطرفية بعد الإصابة العصبية، تجدد قوة حين عدم تجديد الفرع المركزي. نظراً لارتفاع قدرة التجدد، تجديد إكسون الحسية وقد استخدمت على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة تجديد إكسون الثدييات في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) والجهاز العصبي المركزي (CNS). هنا، يمكننا وصف بروتوكول نهج المتبعة سابقا للتلاعب بالجينات في الخلايا العصبية الحسية ناضجة في فيفو عبر انهانسر. استناداً إلى تعداء مع البلازميدات أو أوليجوس صغيرة من الحمض النووي الريبي (سيرناس أو ميكرورناس)، النهج الذي يسمح لكل التجارب الخسارة والربح-من-وظيفة لدراسة أدوار الجينات للمصالح أو ميكرورناس في تنظيم إكسون التجدد في فيفو. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التحكم التلاعب بالجينات التعبير في فيفو مكانياً وزمنياً على حد سواء ضمن دورة زمنية قصيرة نسبيا. ويوفر هذا النظام النموذجي أداة فريدة للتحقيق في الآليات الجزيئية التي يتم التجديد إكسون الثدييات الخاضعة للتنظيم في فيفو.

لتحديد سيتوتوكسيسيتي من البروتوكول الحالي والتحقق من أن معدل تعداء في فيفو انهانسر الرسم عالية بما يكفي، وإننا حقن وميكرورنا معلم فلوريسسينتلي اليكتروبوراتيد أو siRNA في L4 و L5 باﻷسعار. تم تجهيز باﻷسعار منفصلة عن طريق تقطيع البرد وإيمونوهيستوتشيميستري (ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion at JoVE.com

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

انهانسر نهج فعال لتوصيل الجينات المصالح إلى الخلايا. بتطبيق هذا النهج في فيفو على الخلايا العصبية العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار (DRG)، يصف لنا نموذجا لدراسة إكسون التجدد في فيفو.

التحقيق إكسون الثدييات التجديد: في فيفو انهانسر من العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

This method provides an in-vivo gene transfection technique to manipulate gene expression in adult mouse sensory neurons for future studies of mammalian exo-regeneration. The main advantage of this technique is that it's less labor and time consuming, and can both overexpress and knock down the target genes simultaneously and separately. To begin this procedure, mark both sides of the iliac crest of an anesthetized mouse with a fine marker.Draw a line connecting two points of the iliac crest to facilitate the identification of L5 DRGs positions. Then, make a three centimeter incision along the midline of the lower back with micro scissors. Afterward, detach the paraspinous muscles, such as the musculus multifidus and the musculus longissimus lumborum, from the L3 to S1 spinous processes, and expose the fascia joint of the L4-5 and L5-6.Next, use a micro rongeur to remove the fascia joints of the L4-5 and L5-6. Subsequently, remove the left neural arch of L4 and L5, to expose the dorsal side of the DRGs. For DRG injection, load the DNA plasmids or RNA oligos into the glass capillary pipette.Then, insert the tip of the capillary glass pipette, carefully, into the DRG, and gradually inject one microliter solution of DNA plasmids or RNA oligos using the intracellular micro injection dispense system. For electroporation, pinch the target DRG with the electrodes gently, and apply five square electric pulses with the electroporation system. Subsequently, close the muscle, then the skin layers with nylon sutures.Two or three days after the DRG electroporation, anesthetize the mouse intraperitoneally, tape its limbs on the cork board, and make a one centimeter incision 0.5 centimeters to the left side along the midline. Next, cut the muscles, such as gluteus maximus muscle and piriformis muscle, longitudinally. Then, expose the segment of the sciatic nerve between the greater sciatic foramen, and the sciatic notch.Crush the nerve with microsurgery forceps for 12 seconds, and mark the crush site with a nylon epineural suture. Afterward, close the muscle and skin layers with nylon suture. After profusion, separate the DRGs together with the nerve roots and sciatic nerve, carefully, with micro scissors and micro forceps under the dissection microscope.Then, transfer the sciatic nerve directly in 4%PFA overnight at four degrees celsius. To image and measure the fluorescence labeled sensory axons under the dissection microscope, strip off the attached tissue and membrane on the fixed sciatic nerve with micro scissors and micro forceps, carefully. Then, wash the nerve with PVS three times.Next, place the sciatic nerve on a slide and keep it straight. Add 80 microliters of anti-fade solution around the nerve, then lay a cover slip on it. Flatten the whole mounted tissue with pressure.Afterward, place the flattened tissue under the inverted epifluorescence microscope, equipped with an accessory for mosaic acquisition and image processing. When measuring the length of regenerated axons, trace all identifiable fluorescently labeled axons in the sciatic nerve from the crush site to the distal axon ends. When applying the current, in-vivo electroporation method to study axonal regeneration, the sciatic nerve was flattened and imaged.Every regenerated axon with distinctive trajectory and recognizable distal axon end, can be traced from the crush site indicated by the suture knot. The white arrowhead, arrow, and star, indicate three distinctive axon ends, all of which extend from the crush site. Additionally, the DRGs were electroporated with EGFP plasmids, and the spinal cord was harvested.The EGFP labeled, dorsal column axons, in the spinal cord, were imaged and identified in both the longitudinal and sagittal projecting images. Here is a detailed view of axons in the dorsal column, and here is a detailed view of axons in the the dorsal root entry zone. This image shows the sagittal projection of the EGFP labeled axons within the dorsal column.Alternatively, the confocal images can be processed with microscopy visualization software to reconstruct a 3D image. While attempting this procedure, it's important to remember to position the L4 and the L5 DRGs correctly, and to make a knot on the dural membrane without impaling the sciatic nerve, while labeling the crush site with a suture knot. After its development, this technique pave the way for researchers in the field of axon regeneration to explore genes that are required for PNS, natural axon regeneration, or genes that can further promote regeneration in adult mouse in-vivo.