Forfatterne takke Pippa Hawes for at hjælpe med den Konfokal billeddannelse. Dette projekt blev støttet af bioteknologien og Biological Sciences Research Council (BBSRC) tilskud BBS/E/jeg/00007034 og BB/L014262/1.

1. forberedelse af Cas9/gRNA udtryk og Donor konstruerer
<ol><li>
Opførelse af Cas9/gRNA udtryk plasmider
	<ol>
<li>Designe en gRNA sekvens målretning intergenic regionen mellem UL45 og UL46 gener af HVT som tidligere beskrevet22. Juster guide-RNA target sekvens mod HVT genom at udelukke enhver potentiel off mål sekvenser i HVT genom. Syntetisere og klone gRNA sekvensen målretning UL45/46 region og sg-en sekvens fra offentliggjorte data23 i pX459-V2 som tidligere beskrevet22. Kontrollere den klonede gRNA sekvens af Sanger sekventering bruger U6-Fwd primer24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opførelsen af donor plasmid
	<ol>
<li>For at generere en donor plasmid som indeholder de VP2 udtryk kassette markeret med en aftagelig normal god landbrugspraksis reporter kassette, designe oligos Donor-F og Donor-R indeholder følgende elementer (figur 1A og figur 3A): et SA-A Target sekvensen i begge ender, en PacI site flankeret med to LoxP sekvenser for normal god landbrugspraksis reporter kassette kloning og excision og to SfiI websteder for kloning af VP2 udtryk kassette.</li>
		<li>Klone sekvens i en pGEM-T-let vektor, og derefter, klon normal god landbrugspraksis og VP2 gen kassetter i den resulterende vektor til at generere donor plasmid udpeget som pGEM-sgA-normal god landbrugspraksis-VP222. Bemærk: Enhver kloning vektor kan bruges til at konstruere donor plasmid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmid DNA forberedelse
	<ol>
<li>Forberede både donor plasmid og Cas9/gRNA udtryk plasmid DNAs ved hjælp af en kommerciel DNA udvinding kit ifølge producentens anvisninger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CRISPR/Cas9-medieret Knock-i: Transfektion og infektion
<ol><li>Dagen før Transfektion, forberede Transfektion/infektion, ved hjælp af 10 - dage gamle embryoner i M199 medium suppleret med 5% føtal bovint serum (FBS), 10% tryptose fosfat bouillon, 100 U/mL penicillin-streptomycin, kylling embryo fibroblaster (CEFs) og 0,25 µg/mL fungizone. Frø 1,3 x 106 celler pr. brønd i hver brønd med en 6-godt plade i 2,5 mL af medium. Bemærk: CEF celler kan opbevares i 3 d ved 4 ° C.</li>
	<li>Transfect CEF celler (forberedt i trin 2.1) med 0,5 µg for UL45/46-gRNA, 0,5 µg sg-a og 1 µg for pGEM-sgA-normal god landbrugspraksis-VP2 ved hjælp af en passende Transfektion reagens ifølge producentens anvisninger. Inkuber celler i 12 timer i en inkubator (på 38,5 ° C med 5% CO2).</li>
	<li>12 h posttransfection af Cas9/gRNA og donor plasmider, fortyndes HVT virus lager med M199 næringssubstrat til 1 x 105 pfu/mL. Tilføje 130 µL af de fortyndede virus i hver brønd i de transfected celler og sæt et godt af untransfected celler som en negativ kontrol med den samme mængde af virus. Inkubér transfekteret/inficerede celler for 3 d på 38,5 ° C med 5% CO2. Udføre alle procedurer ved hjælp af den fælles kodeks (JCoPR) godkendt af finansieringskilderne.</li>
</ol>3. høst og rensning af HVT rekombinant Virus
<ol><li>
Fluorescens-aktiveret celle sortering
	<ol>
<li>Forbered to 96-brønd plader preseeded med 2 x 104 CEF celler pr godt dagen før sorteringen.</li>
		<li>Trypsinize transfekteret/inficerede CEFs 3 d efter infektion. Opsug medium fra hver brønd og skyl celle ark med fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Der tilsættes 1 mL 0,05% trypsin-EDTA (0,48 mM) til trypsinize celler i 38,5 ° C rugemaskinen i ca 5 min.</li>
		<li>Resuspend og overføre cellerne i et 1,5 mL microcentrifuge rør med 50 µL af FBS. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 min.</li>
		<li>Resuspend celler i 1 mL PBS med 1% FBS. Tælle celle tal ved hjælp af en hemocytometer og justere antallet af celler til 1 x 106 celler/mL. Bemærk: Celler kan opbevares på køl i 1-2 timer.</li>
		<li>Overfør celler til en polystyren sortering rør gennem sin si cap. Sortere de enkelte celler udtryk for normal god landbrugspraksis i 96-brønd plader med CEFs ved hjælp af celle sorteringsanlæg ifølge fabrikantens anvisninger. Inkuber de sorterede celler for 5 d på 38,5 ° C med 5% CO2. Bemærk: En passage af af rekombinante virus kan være nødvendig før sortering hvis der er for mange enkelt normal god landbrugspraksis-udtrykket celler og få normal god landbrugspraksis-positive plaques i den oprindelige brønd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging af rekombinant vira
	<ol>
<li>Forbered 6-godt plader med 1,3 x 106 CEF celler pr godt dagen før passagen. 5 d postsorting, kontrollere 96-brønd pladerne under et fluorescens mikroskop. Markere de brønde, der indeholder en enkelt normal god landbrugspraksis-positive plak. Bemærk: Se figur 2A for en repræsentativ normal god landbrugspraksis-positive plak.</li>
		<li>Trypsinize hver normal god landbrugspraksis-positive godt med 50 µL af trypsin-EDTA i 3 min, tilsæt 50 µL af næringssubstratet, resuspend og overføre cellerne i en brønd på en 6-godt plade med CEFs. Dette vil være den første generation af rekombinant HVT.</li>
		<li>Høste den første generation af rekombinant virus 3 d senere, fryse ned et hætteglas med hver 1 ml frysning medium indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS), 10% dimethylsulfoxid (DMSO) og 80% næringssubstrat, og gemme virus i flydende kvælstof. Bemærk: Høst tid varierer fra 2-4 d afhængigt af virus mængden og spredning kapacitet.</li>
		<li>Indsamle 1 x 105 celler hver første generation af vira, centrifugeres dem, og supernatanten. Gemme celler ved-20 ° C til DNA-ekstraktion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Påvisning af genomisk indsættelse ved polymerase kæde reaktion
	<ol>
<li>DNA-ekstraktion, afrim og resuspenderes celle fra trin 3.2.4 med 50 µL af squishing buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl, og 200 µg/mL Proteinase K) og lyse prøver på 65 ° C i 30 min. og , derefter ved 95 ° C i 2 min til at inaktivere Proteinase K.</li>
		<li>Udføre en polymerase kædereaktion (PCR) med 3' krydset primere (tabel 1) ved hjælp af 1 µL af DNA-prøve. For hver prøve, forberede de følgende 20 µL mastermix på is: 2 x PCR Master Mix (10 µL), 10 µM opstrøms primer (0,5 µL), 10 µM downstream primer (0,5 µL), DNA skabelon (1 µL) og nukleasen-gratis vand (8 µL). Programmet forstærkning er: 95 ° C i 2 min.; 95 ° C til 30 s, 55 ° C til 30 s, og mindst 72 ° C til 40 s for 35 cykler; 72 ° C i 7 min. belastning 2 µL af forstærkning produkter til et godt af 1%-agarosegel til gelelektroforese. Bemærk: Se figur 2A for et repræsentativt resultat af 3' krydset PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. excision af fluorescerende Reporter gen via Cre-lox System
<ol><li>At fjerne normal god landbrugspraksis gen fra rekombinante virus, transfect 2 µg af Cre recombinase udtryk plasmid i 6-godt pladen preseeded med CEF celler, ved hjælp af en Transfektion reagens efter fabrikantens anvisninger.</li>
	<li>12 h posttransfection, afrimning ét hætteglas af rekombinant virus fra flydende kvælstof, resuspend forsigtigt, frø 50 µL i hver brønd i transfekteret celler, og Angiv et godt som den negative kontrol med det samme beløb af virus. Inkuber i 3 d på på 38,5 ° C med 5% CO2.</li>
</ol>5. plaque rensning
<ol><li>
Fluorescens-aktiveret celle sortering
	<ol>
<li>Frø to 96-brønd plader med 2 x 104 CEF celler pr godt dagen før sorteringen.</li>
		<li>Følg fremgangsmåden i trin 3.1 72 h efter infektion (fra trin 4) for at forberede de inficerede celler til sortering. Sortere enkelt nonfluorescence cellerne i 96-brønd plader med CEFs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging af af rekombinante vira og PCR bekræftelse
	<ol>
<li>Vælg 5-10 enkelt nonfluorescence plaques 5 d postsorting, trypsinize dem med 50 µL af trypsin-EDTA på 38,5 ° C i 3 min og tilsæt 50 µL af næringssubstratet til resuspend cellerne. Bemærk: Se figur 2B for en repræsentativ normal god landbrugspraksis-negative plak.</li>
		<li>Passere halvdelen af cellerne i hver brønd med en 6-godt plade preseeded med CEFs som anden generation.</li>
		<li>Centrifugeres de resterende celler af hver klon på 200 x g i 5 min, supernatanten fjernes, og pelleten celler med 50 µL af squishing buffer til DNA-ekstraktion.</li>
		<li>Udføre PCR med 5' krydset primere (tabel 1) ved hjælp af 1 µL af DNA skabelon med samme PCR reaktion tilstand som beskrevet i trin 3.3.2. Bemærk: Se figur 2B for et repræsentativt resultat af 5' krydset PCR.</li>
		<li>Baseret på PCR-resultater, skal du vælge tre til fem positive kloner af rekombinant HVT for yderligere passager og verifikation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. kontrol af af rekombinante HVT
<ol><li>
Indirekte immunfluorescens assay
	<ol>
<li>Inficere CEFs med anden generation af rekombinant HVT fremstillet af trin 5.2 i 24-godt plade seedede med 2,5 x 105 CEFs dagen før infektionen. Fjern celle kultur mellemlang 48t efter infektion og tilsæt 500 µL af 4% PARAFORMALDEHYD i PBS til at fastsætte cellerne. Inkuber plade ved stuetemperatur i 30 min, og derefter fjerne fiksativ og vaske cellelag 3 x med PBS. Bemærk: Cellerne kan opbevares ved 4 ° C på dette trin i flere uger.</li>
		<li>Fjerne PBS og tilsættes 500 µL af 0,1% Triton X-100 til at permeabilize celler i 15 min. Skyl cellen layer 3 x med PBS.</li>
		<li>Blok uspecifik bindende ved at tilføje blokerende buffer (5% bovint serum i PBS) i 1 time.</li>
		<li>Fortynd det primære antistof anti-VP2 monoklonalt antistof HH7 - eller HVT-inficerede kylling serum på 1:200 i blokerende buffer, tilføje 200 µL pr. brønd og Inkuber ved stuetemperatur i 1 h. vask cellen layer 3 x med PBS.</li>
		<li>Fortynd sekundær antistof ged anti-mus IgG Alexa 568 eller ged anti-kylling IgG Alexa 488 på 1:200 i blokerende buffer, tilføje 200 µL pr. brønd, Inkuber ved stuetemperatur i 1 time og vaske cellerne 3 x med PBS. Kontrollere udtrykket protein under fluorescens mikroskop. Bemærk: Se figur 4 for en repræsentant VP2 farvning resultat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekventering af VP2-genet
	<ol>
<li>Forstærke DNA-sekvens der spænder over de UL45 og UL46 intergenic region med high-fidelity DNA polymerase og primere UL45-F1 og UL46-R1 (tabel 1) til at opdage hele indsættelsen.</li>
		<li>Forbered de følgende 50 µL mastermix: 5 µL af 10 x Pfx mastermix, 1,5 µL af 10 µM opstrøms og nedstrøms primer mix, 1 µL af 10 mM dNTP mix, 1 µL af 50 mM MgSO4, 1 µL af DNA skabelon og 0,5 µL af Pfx DNA polymerase , og der tilsættes 50 µL nukleasen-gratis vand. Programmet forstærkning er: 95 ° C i 2 min.; 95 ° C i 15 s, 55 ° C til 30 s og 68 ° C i 3 min til 35 cykler. Indlæse alle af PCR produktet til 1% agarosegel til gelelektroforese.</li>
		<li>Rense PCR produktet efter instruktion af en DNA gel rensning kit. Send 10 µL af PCR produkt (30 ng/µL) til en sekvensering selskab at bekræfte knock-i af VP2-genet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. stabilitet af af rekombinante Virus
<ol><li>Frø 2,6 x 106 CEF celler i hver T25 kolbe dagen før i virus ekspansion.</li>
	<li>Tø mindst tre positive kloner fra trin 5.2; tilføje et hætteglas af celler/vira i hver T25 kolbe. Der inkuberes ved 38,5 ° C med 5% CO2 indtil en 50% cytopatisk effekt er observeret.</li>
	<li>Høste cellerne i 2 mL af næringssubstratet; inficere 50 µL til en ny T25 kolbe preseeded med CEF celler for den næste generation. Holde passaging rekombinant virus for mindst 15 generationer. Analysere hver generation af virus ved PCR for tilstedeværelsen af VP2 sekvens og ved indirekte immunofluorescens assay (IFA) for VP2 udtryk at vurdere stabiliteten af de rekombinante vira.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Witter, R. L., Solomon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+turkeys+and+chickens+with+a+herpesvirus+of+turkeys+(HVT).">Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT).</a> Avian Diseases. 16 (1), 34-44 (1972).</li><li>Baigent, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesvirus+of+turkey+reconstituted+from+bacterial+artificial+chromosome+clones+induces+protection+against+Marek's+disease.">Herpesvirus of turkey reconstituted from bacterial artificial chromosome clones induces protection against Marek's disease.</a> Journal of General Virology. 87, 769-776 (2006).</li><li>Messerle, M., Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H., Koszinowski, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+mutagenesis+of+a+herpesvirus+genome+as+an+infectious+bacterial+artificial+chromosome.">Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14759-14763 (1997).</li><li>Zhao, Y., Nair, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+repeat+regions+of+herpesviruses+cloned+as+bacterial+artificial+chromosomes.">Mutagenesis of the repeat regions of herpesviruses cloned as bacterial artificial chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 634, 53-74 (2010).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+rats+with+conditional+alleles+using+CRISPR/Cas9.">Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.</a> Cell Research. 24 (1), 122-125 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via.+Cas9/RNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos.">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via. Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+chicken+Stra8+gene+knockout+and+inhibition+of+male+germ+cell+differentiation.">CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation.</a> PLoS One. 12 (2), 0172207 (2017).</li><li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+targeted+editing+of+large+viral+genomes+by+RNA-guided+nucleases.">High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases.</a> PLoS Pathogens. 10 (5), 1004090 (2014).</li><li>Bierle, C. J., Anderholm, K. M., Wang, J. B., McVoy, M. A., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+of+guinea+pig+cytomegalovirus+using+CRISPR/Cas9-mediated+gene+editing.">Targeted mutagenesis of guinea pig cytomegalovirus using CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> Journal of Virology. 90 (15), 6989-6998 (2016).</li><li>Suenaga, T., Kohyama, M., Hirayasu, K., Arase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+large+viral+DNA+genomes+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system.</a> Microbiology and Immunology. 58 (9), 513-522 (2014).</li><li>Xu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+approach+to+manipulate+pseudorabies+virus+genome+by+CRISPR/Cas9+system.">A simple and rapid approach to manipulate pseudorabies virus genome by CRISPR/Cas9 system.</a> Biotechnology Letters. 37 (6), 1265-1272 (2015).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+editing+the+vaccinia+virus+genome+by+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5176-5179 (2015).</li><li>Yuen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+of+Epstein-Barr+virus+in+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells.</a> Journal of General Virology. 96, 626-636 (2015).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+and+Cre/Lox+system-based+express+vaccine+development+strategy+against+re-emerging+Pseudorabies+virus.">A CRISPR/Cas9 and Cre/Lox system-based express vaccine development strategy against re-emerging Pseudorabies virus.</a> Scientific Reports. 6, 19176 (2016).</li><li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+duck+enteritis+virus-based+vaccine+against+H5N1+avian+influenza+virus+and+duck+Tembusu+virus+infection.">Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus-based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1478 (2017).</li><li>Peng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudorabies+virus+can+escape+from+CRISPR-Cas9-mediated+inhibition.">Pseudorabies virus can escape from CRISPR-Cas9-mediated inhibition.</a> Virus Research. 223, 197-205 (2016).</li><li>Tang, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+pseudorabies+virus+developed+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Live attenuated pseudorabies virus developed using the CRISPR/Cas9 system.</a> Virus Research. 225, 33-39 (2016).</li><li>Yao, Y., Bassett, A., Nair, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+editing+of+avian+herpesvirus+vaccine+vector+using+CRISPR/Cas9+nucleases.">Targeted editing of avian herpesvirus vaccine vector using CRISPR/Cas9 nucleases.</a> Journal of Vaccine and Technologies. 1, (2016).</li><li>Tang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+approach+to+develop+recombinant+avian+herpesvirus+vectored+vaccines+using+CRISPR/Cas9+system.">A simple and rapid approach to develop recombinant avian herpesvirus vectored vaccines using CRISPR/Cas9 system.</a> Vaccine. 36 (5), 716-722 (2018).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock-in+of+large+reporter+genes+in+human+cells+via.+CRISPR/Cas9-induced+homology-dependent+and+independent+DNA+repair.">Knock-in of large reporter genes in human cells via. CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair.</a> Nucleic Acids Research. 44 (9), 85 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Petherbridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+Gallid+herpesvirus+3+(Marek's+disease+virus+serotype-2)+genome+as+infectious+bacterial+artificial+chromosomes+for+analysis+of+viral+gene+functions.">Cloning of Gallid herpesvirus 3 (Marek's disease virus serotype-2) genome as infectious bacterial artificial chromosomes for analysis of viral gene functions.</a> Journal of Virological Methods. 158 (1-2), 11-17 (2009).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

CRISPR/Cas9-system er blevet et værdifuldt værktøj i gen redigering. De traditionelle teknologier til rekombinant HVT vektor udvikling, såsom homologe rekombination13 og BAC mutagenese teknologi25, indebærer normalt flere runder af vektor kloning og udvalg samt omfattende screening, som kan tage flere måneder. Protokollen beskrevet her ved hjælp af en NHEJ-CRISPR/Cas9-baseret strategi kombineret med Cre-Lox system og én celle sortering er mere en praktisk, effektiv og hurtigere tilgang i rekombinant vaccine generation. Ved hjælp af denne rørledning, den rekombinante virus kan opnås inden for kun 1-2 uger24, og plaque rensning trin kan også reduceres til en enkelt-skuds adskillelse ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering17. Hele processen, fra gRNA design og donor konstruktion til at få renset rekombinant HVT virus, kan nås inden for 1 måned. Kritiske trin til vellykket rekombinant HVT generation omfatter højeffektiv gRNA udvalg for at målrette det virale genom for at sikre effektiv kavalergang for udenlandske gen indsættelse, høj Transfektion effektivitet til at maksimere chancen for Cas9 / gRNAs og virus til at mødes i den samme celle til redigering, og 12 timers interval mellem Transfektion af donor og gRNA plasmider og virusinfektion at lade Cas9 og gRNA udtrykkes på et rimeligt niveau, før virussen kommer ind i cellerne.
Begrænsning for HVT rekombinant generation er kompleksiteten af identifikation af normal god landbrugspraksis-positive kloner af krydset PCR. Normal god landbrugspraksis-VP2 kassetter kunne indsættes i enten orientering. Krydset PCR beskrevet her er kun til identifikation af Indsæt i forstand orienteringen. I tilfælde af insertet i antisense orientering, PCR ved hjælp af primer par beskrevet ville ikke arbejde, og de interne primere kunne byttes til dette formål. Et andet potentielt problem er donor konstruktion kan kun bruges til ét gen indsættelse i den samme virus som følge af eksistensen af den resterende LoxP rækkefølge efter normal god landbrugspraksis fjernelse af Cre behandling. En ny donor konstruktion med en variant LoxP sekvens kunne bruges i stedet for en multiple indsættelse formål.
NHEJ og HDR (homologi-instrueret reparation) er de to veje hen til lave den dobbelt-strenget pauser (DSBs) oprettet af Cas926,27. NHEJ er mere effektiv, da den forekommer i hele cellecyklus28, HDR er mindre effektive og kun opstår under S og G2 faser6,29,30. Vi udnyttede den mere effektive NHEJ reparation pathway her for at indføre de fremmede gener i målrettede placeringer. Selv om NHEJ reparation kan indføre indels ved at deltage i noncompatible eller beskadigede DNA enderne gennem en homologi-uafhængig mekanisk fleksible proces31,32 mellem kløvet donor sekvens og genomisk DNA, indels kan kun ske på kavalergang lokaliteter af sgA, og udenlandske genekspression kassette påvirkes ikke. En anden fordel ved denne tilgang er, at NHEJ er fri for begrænsning af homologi arm konstruktion, at kloning trin meget ligetil. Dette bliver bedt om et stort potentiale for anvendelse af NHEJ for udenlandske gen indsættelse. Indførelsen af en universel gRNA målwebstedet på begge ender af udenlandske gen kassette gør processen hurtigere som skabelonen donor kan konstrueres med det samme uden behov for særlige gRNA udvalg. Rygraden i donor plasmid som indeholder sgA target websteder, LoxP steder og PacI og SfiI websteder kan også deles bredt mellem forskellige reporter gener, udenlandske genekspression kassetter og forskellige virus vektorer, giver denne nye tilgang fordel af tilpasning.
HVT-husly VP2 Indsæt blev brugt til at beskrive protokollen i dette håndskrift; men samme tilgang kan bruges til at indsætte mere virale gener på forskellige genomisk placeringer af HVT genom ved hjælp af gRNA rettet mod den ønskede tilsvarende sekvens til udvikling af multivalent rekombinant HVT vektoriserede vacciner. Andre MDV vaccinestamme, som SB-1 og CVI988, andre aviær herpesvirus, herunder infektiøs laryngotracheitis virus og duck enteritis virus og også andre aviær DNA virus, såsom pox virus og adenovirus, kan også være manipuleret ved hjælp af den samme tilgang til multivalent rekombinant vaccine udvikling. Udvikling af nye multivalent vektoriserede vacciner ved hjælp af CRISPR/Cas9 system platform beskrevet her vil være meget gavnlige for fjerkræindustrien til beskyttelse mod flere fjerkræsygdomme.

Mareks sygdom (MD) er en Lymfoproliferative sygdom af kyllinger induceret af serotype 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) af slægten Mardivirus i underfamilie af Alphaherpesvirinae. Mardivirus indeholder også to nonpathogenic serotyper: serotype 2 (GaHV-3) og serotype 3 (MeHV-1, historisk kendt som HVT) der anvendes som vacciner mod MD. Levende HVT vaccine (FC-126 stamme) er den første generation af MD vaccine bruges i begyndelsen af 1970 ' erne og er stadig bliver brugt bredt i bivalent og polyvalent vaccine formuleringer til en forbedret beskyttelse mod MD. HVT er også almindeligt anvendt som en vaccine vektor til fremkalde beskyttelse mod en række aviær sygdomme på grund af sin alsidighed og sikkerhed for både i ovo og subkutane rugeri administration og evnen til at give en livslang immunitet. Strategi til at generere rekombinant HVT vacciner er baseret på enten konventionel homologe rekombination i virus-inficerede celler, overlappende cosmid DNAs eller BAC mutagenese2. Men disse metoder er generelt tidskrævende og arbejdskrævende, kræver opbygningen af overførsel vektorer, vedligeholdelse af det virale genom i Escherichia coli, plaque purifications, og fjernelse af BAC sekvens og udvalg markør fra redigerede virus3,4.
CRISPR/associerede (Cas9) er den mest populære gen redaktion værktøj i de seneste år på grund af sin alsidighed og specificitet. CRISPR/Cas9-systemet har været med succes brugt i effektiv generation af genetisk modificerede celler og dyremodeller5,6,7,8,9,10, som samt i manipulation af flere store DNA virus genomer11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Efter rapportering af en enkel og effektiv metode bruger CRISPR/Cas9 system til at redigere HVT genom21, udviklede vi en rørledning til hurtig og effektiv generation af rekombinant HVT22.
For at udvide den potentielle anvendelse af denne metode, beskriver vi den detaljerede metodologi for generation af rekombinant HVT vaccine giver udtryk for VP2-gen af IBDV på UL45/46 locus i denne betænkning. Metoden kombinerer NHEJ-CRISPR/Cas9 for at indsætte det VP2 gen markeret med normal god landbrugspraksis reporter gen og Cre-LoxP system til at fjerne normal god landbrugspraksis udtryk kassette senere. Sammenlignet med traditionelle rekombination og BAC recombineering teknikker, viser vi, at NHEJ-CRISPR/Cas9 samt en Cre-Lox system er en hurtig og effektiv tilgang til at generere rekombinant HVT vaccine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:988px;" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">M199 medium, Earle&#39;s Salts</td>
			<td style="width:221px;">Life technology</td>
			<td style="width:163px;">11150059</td>
			<td style="width:235px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140148</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td>antifunigal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8782</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HVT Fc126 strain</td>
			<td>Avian Disease and Oncology Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>wildtype HVT virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pX459-v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #62988</td>
			<td>Cas9 and gRNA expression vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-T Easy Vector Systems</td>
			<td>promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>rR0547S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SfiI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0123S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-X2</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 6004</td>
			<td>transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture 6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td>junction PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum Pfx DNA Polymerase</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11708021</td>
			<td>PCR amplification of full insert</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica TCS SP5 LASAF</td>
			<td>immunoflourescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS cell sorter</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td>single cell sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (4% in PBS)</td>
			<td>Santa cruz biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30960</td>
			<td>permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing

Herpesvirus af kalkuner (HVT) er en ideelle viral vektor for generation af rekombinante vacciner mod en række aviær sygdomme som aviær influenza (AI), Newcastle disease (ND) og smitsomme bursal disease (IBD), ved hjælp af bakteriel kunstige kromosom ( BAC) mutagenese eller konventionelle rekombination metoder. De grupperede regelmæssigt interspaced palindromiske gentagelser (CRISPR) / Cas9 systemet held har været anvendt i mange indstillinger for gen redigering, herunder manipulation af flere store DNA virus genomer. Vi har udviklet en effektiv og hurtig CRISPR/Cas9-medieret genom redigering rørledningen for at generere rekombinant HVT. For at maksimere den potentielle anvendelse af denne metode, præsenterer vi her detaljerede oplysninger om metoden til at generere rekombinant HVT udtrykker VP2 protein af IBDV. VP2 udtryk kassette er isat i HVT genom via en NHEJ (nonhomologous slutningen-sammenføjning)-afhængige reparation pathway. En grøn fluorescens protein (NGL) udtryk kassette er først knyttet til indsatsen til nem visualisering og derefter fjernet via Cre-LoxP system. Denne tilgang tilbyder en effektiv måde at indføre andre virale antigener i HVT genom for den hurtige udvikling af rekombinante vacciner.

Den strategi, der anvendes for generation af rekombinant HVT vaccinen er skitseret i figur 1, som omfatter hvordan donoren plasmid er konstrueret (fig. 1A) og procedurer til at generere rekombinant HVT (figur 1B ). Five-tredive normal god landbrugspraksis-positive plaques omgivet af vildtype plaques kan observeres i gen banke i brønde under fluorescens mikroskop 3 d posttransfection og -infektion. Renset virus opnås efter én celle sortering (fig. 2A) blev analyseret af 3' krydset PCR, som viser et PCR-produkt af den forventede størrelse (figur 2A, nederste panel). Efter excision af normal god landbrugspraksis reporter af Cre recombinase mistet over 50% af plaques deres normal god landbrugspraksis udtryk. Renset plak efter normal god landbrugspraksis excision (figur 2B) af enkelt celle sortering blev yderligere bekræftet af 5' krydset PCR, som viser højre-sized PCR produktet (figur 2B, nederste panel). Figur 3 viser sekventering resultaterne af begge junction PCR produkter med forskellige farvede elementer. I figur 4, blev protein udtryk bekræftet af IFA med VP2-specifikke monoklonale antistof, og anti-HVT kylling serum. Som forventet, kan celler inficeret med forældrenes HVT kun blive plettet af anti-HVT serum (grøn), mens rekombinant HVT-inficerede celler viste klart udtryk af VP2 gen (rød).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg"> Figur 1: strategi for generation af en rekombinant HVT-vektoriserede vaccine. (A) dette panel viser en skematisk fremstilling af kloning strategi for donor plasmid konstruktion. De centrale elementer omfatter to Cas9 målwebsteder (sgA) for at frigive indsættelse, en reporter normal god landbrugspraksis kassette flankeret med LoxP sekvenser for excision af normal god landbrugspraksis og VP2 udtryk kassette. (B) dette panel viser en oversigt over en to-trins gen knock-i strategien. Indsæt fragment af normal god landbrugspraksis og VP2 udtryk kassetter er udgivet af Cas9/sgA kavalergang og indsat i HVT genom på UL45/46 loci via NHEJ-CRISPR/Cas9. Normal god landbrugspraksis-positive rekombinant virus er derefter sorteret og renset af encellede fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). Senere, normal god landbrugspraksis reporter gen er skåret ud af Cre recombinase og rekombinant virus er renset og karakteriseret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg"> Figur 2 : Kontrol af af rekombinante HVT. (A) dette panel viser en normal god landbrugspraksis-positive plaque (HVT-normal god landbrugspraksis-VP2) visualiseret under fluorescens mikroskop (toppanelet) og PCR-verifikationen af HVT-normal god landbrugspraksis-VP2 med primere VP2-F & UL46-R1 til 3' krydset. ()B) dette panel viser en plaque (HVT-VP2) visualiseres efter normal god landbrugspraksis excision af HVT-normal god landbrugspraksis-VP2, ved hjælp af Cre recombinase og PCR verifikation af HVT-VP2 med primere UL45-F1 og VP2-R1 for 5'-krydset. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg"> Figur 3 : Sekvens analyse af virussen rekombinant HVT. (A) sekvenserne af de centrale elementer i forskellige farver i dette panel er HVT intergenic regionen mellem UL45/46 med gRNA target sekvens understreget og en pil, der viser Cas9 kavalergang site, VP2 udtryk kassette med afslutningen sekvenser i kursiv små, sg-A mål sekvens i rød med pilen viser webstedet Cas9 kavalergang, LoxP site sekvens i grøn og to SfiI websteder sekvenser i blå. (B) dette panel viser sekventering resultaterne af 5' og 3' knudepunkter og en skematisk præsentation af HVT-VP2 med centrale elementer med tilsvarende farver præsenteret i sekvenser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg"> Figur 4 : Karakterisering af af rekombinante HVT-VP2. Dette panel viser bekræftelse af den vellykkede udtryk for VP2 i inficerede CEFs af indirekte immunfluorescens assay (IFA) med anti-VP2 monoklonalt antistof HH7 (rød). HVT infektionen er bekræftet af IFA med HVT-inficerede kylling serum (grøn). Skalalinjen = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generering af rekombinant aviær Herpesvirus vektorer med CRISPR/Cas9 gen redigering

Herpesvirus af kalkuner (HVT) er udbredt som en vektor platform for generation af rekombinante vacciner mod en række fjerkræsygdomme. Denne artikel beskriver en enkel og hurtig tilgang for generation af rekombinant HVT-vektoriserede vacciner ved hjælp af en integreret NHEJ-CRISPR/Cas9, og Cre-Lox system.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Denne fremgangsmåde er en effektiv måde at indføre andre virusantigener i HVT-genomet på med henblik på hurtig udvikling af rekombinant vacciner. En vis fordel ved denne teknik er, at en GFP udtryk kassette er knyttet til indsætte først for nem visualisering og derefter fjernet af Cre-LoxP system. Den samme fremgangsmåde kan bruges til at indsætte flere virale gener på forskellige steder i HVT-genomet eller andre aviær herpesvirus til udvikling af multivalente rekombinant vacciner.Demonstration af proceduren vil være Katy Moffat, en ekspert i cellesortering. Na Tang, Yaoyao Zhang og Guanggang Qu, forskere fra mit laboratorium. Dagen før transfektion forberede chick embryo fibroblaster som skitseret i tekstprotokollen.Seed 1,3 millioner celler i 2,5 milliliter medium i hver brønd af en seks brønd plade. Transfect CEF-cellerne med 0,5 mikrogram hver af de to Cas9 guide RNA plasmider og et mikrogram af donor plasmid ved hjælp af et passende transinfektionsreagens i henhold til producentens anvisninger. Inkuber cellerne ved 38,5 grader Celsius med 5% kuldioxid i 12 timer.12 timer efter transfektion fortynde HVT virus bestanden med M199 kultur medium til en koncentration på 100, 000 plaque danner enheder pr milliliter. Der tilsættes 130 mikroliter af den fortyndede virus til hver brønd af transficerede celler. Indstil en brønd af ikke-inficerede celler som en negativ kontrol og tilføje den samme mængde virus.Inkuber cellerne ved 38,5 grader Celsius med 5% kuldioxid i tre dage. Dagen før sortering forberede to 96 brøndplader ved såning 20,000 celler i hver brønd. Tre dage efter infektion hente de seks brøndplader, der indeholder transfmittede og inficerede CEFs.Aspirere mediet fra hver brønd og skyl cellearket med PBS. Tilføj en milliliter 0,05% trypsin-EDTA til hver brønd og inkuber cellerne ved 38,5 grader Celsius med 5% kuldioxid i cirka fem minutter. Derefter opslænker cellerne med 50 mikroliter af FBS og overføre denne suspension til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør.Centrifuge ved 200 gange tyngdekraften i fem minutter. Cellerne opslænnes igen i en milliliter PBS, der indeholder 1%FBS. Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne og justere celletætheden til en million celler pr. milliliter.Dernæst overføre cellerne til en polystyren sortering rør gennem sin si cap. Ved hjælp af en celle sortere de enkelte celler, der udtrykker GFP i preseeded 96 brøndplader. Inkuber pladerne med de sorterede celler ved 38,5 grader Celsius med 5% kuldioxid i fem dage.Efter fem dage skal du bruge fluorescensmikroskopet til at kontrollere de 96 brøndplader og markere de brønde, der indeholder en enkelt GFP positiv plak. Trypsinize hver GFP positiv godt med 50 mikroliter af trypsin-EDTA i tre minutter. Derefter tilsættes 50 mikroliter af kulturmediet for at opstivere cellerne og overføre denne suspension til en brønd af en seks brøndplade med CEF'er.Efter tre dage fryses et hætteglas af hver af den første generation af rekombinant vira i frysende medium. Disse høstede vira opbevares i flydende nitrogen. Saml 100.000 celler fra hver af de første generation af virus.Centrifuge cellerne ved 2,000 rpm i fem minutter, og kassér supernatant. Opbevar cellerne ved negative 20 grader Celsius, indtil de er klar til at udføre DNA-ekstraktion. Når du er klar til at udføre DNA-ekstraktion, anvendes 50 mikroliter squishing buffer til optøning og resuspending af cellepiller.Lysning prøverne ved 65 grader Celsius i 30 minutter og derefter ved 95 grader Celsius i to minutter for at inaktivere Proteinase K.Udfør en PCR-reaktion med tre prime junction primere med en mikroliter af hver DNA-prøve som beskrevet i tekstprotokollen. Læg to mikroliter af forstærkningsprodukterne til en brønd på 1% agarosegel til gelelektrophorsis. For at fjerne GFP-genet fra rekombinant virus, skal du bruge et transfektion reagens til at transfect to mikroliter af Cre recombinase udtryk plasmid i de seks brøndplade, der er blevet preseeded med CEF-celler.12 timer efter transfektion afrimning et hætteglas af rekombinant virus fra flydende nitrogen. Forsigtigt resuspend virus og frø 50 mikroliter i hver brønd af transficerede celler, indstilling en samt den negative kontrol med den samme mængde virus. Inkubere ved 38,5 grader Celsius i tre dage.72 timer efter infektion forberede cellerne til sortering som tidligere beskrevet. Sorter de enkelte ikke-fluorescerende celler i en 96 brøndplade forfrøet med CEF'er. Prøv derefter de valgte plaques og resuspenderede de tilsvarende celler som beskrevet i tekstprotokollen.Pass halvdelen af cellerne i hver brønd af en 96 brøndplade, der er blevet preseeded med CEFs som anden generation. Centrifuge de resterende celler i hver klon ved 200 gange tyngdekraften i fem minutter. Kassér supernatanten og opslæm cellerne med 50 mikroliter squishing buffer til DNA-ekstraktion.Derefter udføre PCR med fem prime junction primers ved hjælp af en mikroliter af DNA-skabelon som skitseret i tekstprotokollen. Baseret på PCR-resultaterne vælge tre til fem positive kloner af rekombinant HVT for yderligere passager og verifikation. Først skal cefs med anden generation af rekombinant HVT i en preseeded 24 brøndplade.48 timer efter infektion fjernes kulturmediet og tilsættes 500 mikroliter på 4% paraformaldehyd i PBS for at fikse cellerne. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Fjern derefter fiksativen, og vask cellelaget tre gange med PBS.Fjern PBS og tilsæt 500 mikroliter på 0,1% Triton X-100 for at gennemtrænge cellerne. Efter 15 minutter vaskes cellelaget tre gange med PBS. Tilføj blokeringsbuffer i en time for at blokere ikke-specifikt binding.Derefter fortyndes det primære antistof anti-VP2 monoklonale antistof HH7 eller HVT-inficeret kyllingeserum ved en til 200 i blokerende buffer. Der tilsættes 200 mikroliter af det fortyndede primære antistof til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i en time. Cellelaget vaskes tre gange med PBS.Fortynd den sekundære antistofgede anti-mus IgG Alexa 568 eller ged anti-kylling IgG Alexa 488 på en til 200 i blokering buffer. Der tilsættes 200 mikroliter fortyndet sekundært antistof til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i en time. Vask derefter cellerne tre gange med PBS.Brug fluorescensmikroskopet til at kontrollere proteinudtrykket. Dagen før virus ekspansion frø 2,6 millioner CEF celler i hver T25 kolbe. Tø mindst tre positive kloner op og tilsæt et hætteglas med celler eller vira til hver kolbe.Kolber espøndes ved 38,5 grader Celsius med 5 % kuldioxid, indtil der observeres en cytopatisk effekt på 50 %. Næste høst cellerne i to milliliter af kultur medium. Inficere 50 mikroliter til en ny T25 kolbe, der blev preseeded med CEF celler til næste generation.Fortsæt med at overføre rekombinant virus i mindst 15 generationer. Brug PCR analysere hver generation af virus for tilstedeværelsen af VP2 sekvens. Ved hjælp af en indirekte immunfluorescens assay analysere hver generation af virus af VP2 udtryk.Efter enkelt celle sortering den opnåede renset virus analyseres ved tre prime junction PCR, som viser en PCR produkt af den forventede størrelse. Efter excision af GFP reporter af Cre recombinase over 50% af plaques mistet deres GFP udtryk. Den rensede plak efter GFP excision opnås ved enkelt celle sortering og bekræftes yderligere af fem prime junction PCR, som viser produkt af den forventede størrelse.Proteinudtrykket bekræftes derefter af indirekte immunfluorescensassay med VP2-specifikt monoklonalt antistof og anti-HVT kyllingeserum. Som forventet kan celler inficeret med forældre HVT kun farves ved anti-HVT serum. Mens rekombinant HVT inficerede celler klart viser udtryk for VP2 genet.For at generere en rekombinant virus høj transfektion sats er nødvendig for at maksimere chancen for virus og indsætte at mødes i samme celle for redigering til at finde sted. Efter denne procedure kan der udføres dyreforsøg for at vurdere immunogeniciteten og effekten af de rekombinante vacciner. Udviklingen af nye multivalente vektorvacciner ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemplatform, der er beskrevet her, vil være yderst gavnlig for fjerkræindustrien for at beskytte mod flere fjerkræsygdomme.