Os autores agradecer a Pippa Hawes ajuda com a imagem latente confocal. Este projecto foi apoiado pela biotecnologia e biológicos Sciences Research Council (BBSRC) concede BBS/E/eu/00007034 e BB/L014262/1.

1. preparação da expressão Cas9/gRNA e doador constrói
<ol><li>
Construção de plasmídeo de expressão Cas9/gRNA
	<ol>
<li>Projete uma sequência de gRNA segmentação região intergênica entre genes UL45 e UL46 de HVT conforme descrito anteriormente,22. Alinhe a sequência do alvo do guia-RNA contra o genoma HVT para descartar qualquer sequências alvo potenciais no genoma HVT. Sintetizar e clonar a sequência de gRNA segmentação UL45/46 região e sg-A sequência de dados publicados23 em pX459-V2 conforme descrito anteriormente,22. Verifique se a sequência de gRNA clonado por Sanger sequenciamento usando o U6-Fwd cartilha24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construção do plasmídeo de doador
	<ol>
<li>Para gerar um plasmídeo do doador que contém a fita de expressão VP2 com uma gaveta de repórter GFP removível, projetar oligos doador-F e doador-R que contém os seguintes elementos (Figura 1A e Figura 3A): um sg-A sequência de alvo em ambas as extremidades, um site de PacI, ladeados por duas sequências LoxP de GFP repórter gaveta clonagem e excisão e dois locais de SfiI para a clonagem da fita expressão VP2.</li>
		<li>Clonar a sequência em um vetor pGEM-T-fácil e, em seguida, clonar as fitas de gene GFP e VP2 no vetor resultante para gerar o plasmídeo doador designado como pGEM-sgA-GFP-VP222. Nota: Qualquer vetor de clonagem pode ser usado para construir o plasmídeo do doador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de DNA plasmídeo
	<ol>
<li>Prepare-se tanto do plasmídeo de doador e plasmídeo de expressão Cas9/gRNA DNAs usando um kit comercial de extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CRISPR/Cas9-mediada Knock-em: Transfection e infecção
<ol><li>Anteontem transfeccao, fibroblastos de embrião de pintinho (CEFs) Prepare-se para a transfeccao/infecção, usando embriões 10 dias de idade em M199 suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS), 10% tryptose caldo de fosfato, 100 U/mL penicilina-estreptomicina, e fungizone 0,25 µ g/mL. Semente de 1,3 x 106 células por alvéolo em cada poço de uma placa de 6 em 2,5 mL de meio. Nota: Células CEF podem ser mantidas para d 3 a 4 ° C.</li>
	<li>Transfect células CEF (preparado no passo 2.1) com 0,5 µ g de UL45/46-gRNA, 0,5 µ g de sg-A e 1 µ g de pGEM-sgA-GFP-VP2 usando um reagente de transfeccao apropriado de acordo com as instruções do fabricante. Incube as celulas para 12h em uma incubadora (a 38,5 ° C com 5% CO2).</li>
	<li>posttransfection de 12 h de plasmídeos Cas9/gRNA e doador, diluir o estoque de vírus HVT com meio de cultura M199 a 1 x 105 pfu/mL. Adicione 130 µ l do vírus diluído em cada poço das células transfectadas e defina um poço de células untransfected como um controle negativo com a mesma quantidade de vírus. Incube as celulas transfectadas/infectados para 3 d a 38,5 ° C, com 5% de CO2. Realizar todos os procedimentos usando o código de prática conjunta (JCoPR) aprovado pelos financiadores.</li>
</ol>3. a colheita e a purificação do vírus recombinante HVT
<ol><li>
Classificação de fluorescência-ativado da pilha
	<ol>
<li>Prepare duas placas de 96 poços, feito o preseed com 2 x 104 células de CEF por bem no dia anterior a classificação.</li>
		<li>Trypsinize infectados/transfectadas CEFs 3 d postinfection. Aspire o meio de cada poço e enxaguar a camada de células com tampão fosfato salino (PBS). Adicione 1 mL de 0,05% do trypsin-EDTA (0,48 mM) para trypsinize as células a incubadora de 38,5 ° C por aproximadamente 5 min.</li>
		<li>Resuspenda e transferir as células em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL com 50 µ l de FBS. Centrifugar a 200 x g por 5 min.</li>
		<li>Ressuspender as células em 1 mL de PBS com 1% FBS. Contar o número de células usando um hemocytometer e ajustar o número de células a 1 x 106 células/mL. Nota: As células podem ser mantidas no gelo para 1-2 h.</li>
		<li>Transferi as células para um tubo através de sua tampa de filtro de classificação de poliestireno. Classificar as células única expressando GFP em placas de 96 poços, semeadas com CEFs usando o classificador de célula de acordo com as instruções do fabricante. Incube as celulas classificadas para a 5D a 38,5 ° C, com 5% de CO2. Nota: Uma passagem do vírus recombinante pode ser necessária antes de classificação se houver muitas células de GFP-expressão única e algumas placas de GFP-positivo na fonte original.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passagem de vírus recombinantes
	<ol>
<li>Prepare-se placas de 6 boas semeadas com 1,3 x 106 células CEF por bem o dia antes da passagem. 5 d postsorting, verificar as placas de 96 poços sob um microscópio de fluorescência. Marca os poços que contém uma única placa de GFP-positivo. Nota: Ver Figura 2para uma placa representativa de GFP-positivo .</li>
		<li>Trypsinize cada GFP-positivo bem com 50 µ l de tripsina-EDTA por 3 min, adicionar 50 µ l de meio de cultura, resuspenda e transferir as células em um poço de uma placa de 6 com CEFs. Esta será a primeira geração de recombinação HVT.</li>
		<li>A primeira geração de vírus recombinantes 3 d depois da colheita, congelar para baixo, um frasco de cada um em 1 mL de congelamento médio com soro de vitela fetal de 10% (FCS), meio de cultura de 80% e 10% dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenar os vírus em nitrogênio líquido. Nota: O tempo de colheita varia de 2-4 d dependendo da capacidade de quantidade e proliferação do vírus.</li>
		<li>Recolher a 1 x 105 células cada primeira geração de vírus, centrifugue-las e descartar o sobrenadante. Armazene as células a-20 ° C para a extração de DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deteção de inserção Genômica por reação em cadeia da polimerase
	<ol>
<li>Para a extração de DNA, descongelar e ressuspender as células da etapa 3.2.4 com 50 µ l de tampão a esmagar (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM de NaCl e 200 µ g/mL Proteinase K) e lyse as amostras a 65 ° C por 30 min e , em seguida, a 95 ° C por 2 min inactivar a Proteinase K.</li>
		<li>Execute uma reação em cadeia do polymerase (PCR) com 3' junção primers (tabela 1) usando 1 µ l de amostra de DNA. Para cada amostra, preparar a seguinte mistura de reação de 20 µ l no gelo: 2 x PCR Master Mix (10 µ l), 10 µM montante da primeira demão (0,5 µ l), 10 µM a jusante primer (0,5 µ l), modelo de DNA (1 µ l) e água livre de nuclease (8 µ l). O programa de amplificação é: 95 ° C por 2 min; 95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s e 72 ° C por 40 s para 35 ciclos; 72 ° C por 7 min. carga 2 µ l dos produtos de amplificação para um poço de gel de agarose 1% para a electroforese do gel. Nota: Ver Figura 2para um resultado representativo da junção 3' do PCR .</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. a excisão do Gene repórter fluorescente através do Cre-lox sistema
<ol><li>Para remover o gene GFP de vírus recombinante, transfect 2 µ g do plasmídeo de expressão recombinase Cre na placa 6-bem feito o preseed com células CEF, usando um reagente de transfeccao seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>posttransfection de 12 h, descongelar um frasco de vírus recombinante de nitrogênio líquido, Ressuspender delicadamente, 50 µ l de sementes em cada poço de células transfectadas e definir bem como controlo negativo com a mesma quantidade de vírus. Incube durante 3 d na 38,5 ° C, com 5% de CO2.</li>
</ol>5. placa purificação
<ol><li>
Classificação de fluorescência-ativado da pilha
	<ol>
<li>Semente duas placas de 96 alvéolos com 2 x 104 células de CEF por bem no dia anterior a classificação.</li>
		<li>Siga os procedimentos descritos em postinfection de 72 h passo 3.1 (da etapa 4) para preparar as células infectadas para classificação. Classificar as células nonfluorescence único em placas de 96 poços, semeadas com CEFs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passagem do vírus recombinantes e confirmação de PCR
	<ol>
<li>Escolha placas de nonfluorescence único de 5-10 5 d postsorting, trypsinize-los com 50 µ l de tripsina-EDTA a 38,5 ° C por 3 min e adicionar 50 µ l de meio de cultura para Ressuspender as células. Nota: Consulte a Figura 2B para uma placa representativa de GFP-negativo.</li>
		<li>Passe metade das células em cada poço de uma placa de 6 feito o preseed com CEFs como a segunda geração.</li>
		<li>As células restantes de cada clone a 200 x g por 5 min de centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as células com 50 µ l de buffer para extração de DNA a esmagar.</li>
		<li>Realize PCR com primers de junção 5' (tabela 1) usando 1 µ l do modelo de DNA com a mesma condição de reação de PCR, conforme descrito na etapa 3.3.2. Nota: Consulte a Figura 2B para um resultado representativo de 5' junção do PCR.</li>
		<li>Baseado nos resultados PCR, escolha três a cinco clones positivos de recombinação HVT por mais passagens e verificação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. verificação do HVT recombinante
<ol><li>
Ensaio de imunofluorescência indireta
	<ol>
<li>Infectar o CEFs com a segunda geração de recombinação que HVT obtido de passo 5.2 na placa de 24 semeado com 2,5 x 105 CEFs no dia antes da infecção. Remover o postinfection de 48 h de meio de cultura celular e adicionar 500 µ l de paraformaldeído 4% em PBS para reparar as células. Incube a placa na temperatura ambiente por 30 min e, em seguida, remover o fixador e lavar a camada celular 3 x com PBS. Nota: As células podem ser armazenadas a 4 ° C, a este passo por várias semanas.</li>
		<li>Remova a PBS e adicione 500 µ l de 0,1% Triton X-100 para permeabilize as células durante 15 min. lavar a célula da camada 3x com PBS.</li>
		<li>Ligação inespecífica de bloco pela adição de tampão de bloqueio (5% de soro bovino em PBS) por 1h.</li>
		<li>Diluir o anticorpo monoclonal anti-VP2 anticorpo primário HH7 ou HVT-infectados por soro de frango em 1: 200 em tampão de bloqueio, adicionar 200 µ l por bem e incubar a temperatura ambiente por 1 h. lavagem a célula da camada 3x com PBS.</li>
		<li>Diluir o anticorpo secundário cabra anti-mouse IgG Alexa 568 ou anti-frango de cabra IgG Alexa 488 em 1: 200 em tampão de bloqueio, adicionar 200 µ l por alvéolo, incubar a temperatura ambiente durante 1 h e lavar as células 3 x com PBS. Verifique se a expressão da proteína sob o microscópio de fluorescência. Nota: Consulte a Figura 4 para um representante VP2 manchando o resultado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sequenciamento do gene VP2
	<ol>
<li>Amplifica a sequência de DNA, abrangendo a região intergênica UL45 e UL46 com alta fidelidade de DNA polimerase e primers UL45-F1 e UL46-R1 (tabela 1) para detectar a inserção de toda.</li>
		<li>Preparar a seguinte mistura de reação de 50 µ l: 5 µ l de 10 x Pfx Mix de reação, 1,5 µ l de 10 µM a montante e a jusante da primeira demão mix, 1 µ l do mix de 10mm dNTP, 1 µ l de 50 mM de MgSO4, 1 µ l do modelo de DNA e 0,5 µ l de Pfx DNA polimerase e adicionar a água livre de nuclease a 50 µ l. O programa de amplificação é: 95 ° C por 2 min; 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s e 68 ° C por 3 min para 35 ciclos. Carrega todo o produto do PCR para gel de agarose a 1% para a electroforese do gel.</li>
		<li>Purifica o produto do PCR, seguindo as instruções de um kit de purificação de gel de DNA. Envie 10 µ l de produto da PCR (30 ng / µ l) para uma empresa de sequenciamento para confirmar o bater-do gene VP2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. a estabilidade do vírus recombinante
<ol><li>Semente de 2,6 x 106 CEF células para cada balão T25 no dia anterior a expansão do vírus.</li>
	<li>Descongelar a pelo menos três clones positivos da etapa 5.2; Adicione um frasco de células/vírus em cada frasco T25. Incube a 38,5 ° C, com 5% CO2 até um efeito citopático 50% é observado.</li>
	<li>Colheita das células em 2 mL de meio de cultura; infectar 50 µ l para um balão de T25 novo feito o preseed com células da CEF para a próxima geração. Manter passagem o vírus recombinante pelo menos 15 gerações. Analise cada geração do vírus por PCR, a presença da sequência VP2 e pelo ensaio de imunofluorescência indireta (IFA) para expressão de VP2 avaliar a estabilidade dos vírus recombinantes.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O sistema CRISPR/Cas9 tornou-se uma ferramenta valiosa na edição de gene. As tecnologias tradicionais para recombinante HVT vector do desenvolvimento, como recombinação homóloga13 e BAC mutagênese tecnologia25, geralmente envolvem várias rodadas de vetor de clonagem e seleção, bem como triagem em larga escala, que pode demorar vários meses. O protocolo descrito aqui, usando uma estratégia NHEJ CRISPR/Cas9-baseada combinada com o sistema Cre-Lox e classificação de célula única é mais uma abordagem mais rápida, conveniente e eficiente na geração de vacina recombinante. Usando esse pipeline, o vírus recombinante pode ser obtido dentro de apenas 1-2 semanas24e etapas de purificação de placa também podem ser reduzidas a uma separação de single-redonda usando fluorescência-ativado da pilha classificação17. Todo o processo, desde a construção de design e doador de gRNA para o vírus de HVT recombinante purificada, pode ser alcançado dentro de 1 mês. Os passos críticos para geração de HVT recombinante bem sucedida incluem a seleção de gRNA de alta eficiência para o direcionamento do genoma viral para assegurar eficiente clivagem para a inserção do gene estrangeiro, a eficiência elevada do transfection para maximizar a chance para Cas9 / gRNAs e o vírus se encontrar na mesma cela para edição e o intervalo de 12 horas entre o transfection de plasmídeos o doador e gRNA e a infecção viral para permitir Cas9 e gRNA ser expressa a um nível razoável, antes que o vírus chegue às células.
A limitação para a geração de recombinação HVT é que a complexidade da identificação de GFP-positivo clones pela junção do PCR. As fitas de GFP-VP2 podem ser inseridas em qualquer orientação. A junção que PCR descrito aqui é apenas para a identificação da inserção na orientação sentido. No caso do inserir na orientação antisentida, PCR usando os pares de cartilha descritos não iria funcionar, e os primers internos podem ser trocados para essa finalidade. Outro problema potencial é que a construção do doador só pode ser usada para a inserção de um gene no vírus da mesma devido à existência da sequência LoxP restante após a remoção de GFP por tratamento de Cre. Uma nova construção de doador com uma variante LoxP sequência poderia ser usada para uma finalidade de inserção múltipla.
NHEJ e HDR (reparação de homologia-dirigido) são as duas vias para reparar as quebras de dupla-hélice (DSBs) criadas por Cas926,27. NHEJ é mais eficiente, como ocorre em todo o ciclo celular28, Considerando que HDR é menos eficiente e ocorre apenas durante a S e G2 fases6,29,30. Nós explorada a mais eficiente via de reparo NHEJ aqui para introduzir os genes estrangeiros os locais alvo. Embora a NHEJ reparar pode introduzir puntuais, unindo as extremidades de DNA danificadas ou noncompatible através de uma homologia independente processo mecanicamente flexível31,32 entre a sequência de doador entalhadas e o DNA genômico, o puntuais Só pode ocorrer com os sítios de clivagem de sgA, e a gaveta externa-expressão do gene não é afectada. Outra vantagem desta abordagem é que NHEJ é livre da restrição da construção do braço de homologia, tornando a clonagem passo muito simples. Isso leva a um grande potencial para a aplicação de NHEJ para inserção de gene estrangeiro. A introdução de um site de destino de gRNA universal em ambos termina do gene estrangeiro gaveta torna o processo mais rápido, como o modelo de doador poderia ser construído imediatamente sem a necessidade para a seleção de gRNA específico. A espinha dorsal do plasmídeo de doadores contendo sites de destino do sgA, LoxP sites e sites PacI e SfiI também pode ser compartilhada amplamente entre genes repórter diferente, fitas estrangeiras-expressão gênica e vetores de vírus diferentes, dando a esta nova abordagem a vantagem de personalização.
A inserção de HVT-abrigando VP2 foi usada para descrever o protocolo neste manuscrito; no entanto, a mesma abordagem pode ser usada para inserir mais genes virais em diferentes localizações genômicas do genoma HVT usando a gRNA visando a sequência desejada correspondente para o desenvolvimento de vacinas polivalentes de HVT vectored recombinantes. Outras cepas de vacina MDV, como SB-1 e CVI988, outros herpesviruses aviária, incluindo vírus da laringotraqueite infecciosa e pato enterite e também outros vírus aviária de DNA, tais como o vírus da varíola e adenovírus, também podem ser projetadas usando o mesmo abordagem para desenvolvimento de vacina recombinante multivalentes. O desenvolvimento de novas vacinas em vetor multivalentes usando a plataforma do sistema CRISPR/Cas9 descrita aqui será altamente benéfico para a indústria de aves de capoeira proteger contra várias doenças de aves de capoeira.

Doença de Marek (MD) é uma doença linfoproliferativa de galinhas induzida pelo sorotipo 1 (2 de Herpesvirus Gallid [GAHV-2]) do gênero Mardivirus , da subfamília das Herpesviridae. Mardivirus também inclui dois serótipos não-patogênicas: sorotipo 2 (GaHV-3) e sorotipo 3 (MeHV-1, conhecido historicamente como HVT) que são usadas como vacinas contra MD Vacina viva de HVT (cepa FC-126) é a primeira geração de vacina MD usada na década de 1970 e é ainda a ser amplamente utilizado em formulações de vacina bivalente e polivalente para fornecer uma proteção aprimorada contra MD HVT é também amplamente utilizado como um vetor de vacina para induzir a proteção contra uma série de doenças aviária devido à sua versatilidade e segurança para ambos em ovo e administração subcutânea de incubatório e capacidade para fornecer uma imunidade vitalícia. A estratégia para gerar vacinas recombinantes HVT baseia-se ou recombinação homóloga convencional em células infectadas por vírus, sobreposição do cosmid DNAs ou BAC mutagênese2. No entanto, esses métodos são, geralmente, demorado e trabalhoso, que exige a construção de vetores de transferência, a manutenção do genoma viral em Escherichia coli, purificações de placa bacteriana e a remoção da sequência de BAC e seleção marcador do vírus editado3,4.
CRISPR/associado (Cas9) é o gene mais popular ferramenta de edição nos últimos anos devido à sua versatilidade e especificidade. O sistema CRISPR/Cas9 tem sido usado com sucesso na geração eficiente de células geneticamente modificadas e modelos animais5,6,7,8,9,10, como bem como a manipulação de vários grandes vírus DNA genomas11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Depois de dar um método simples e eficiente, usando o sistema CRISPR/Cas9 para editar o HVT genoma21, desenvolvemos um gasoduto para a geração rápida e eficiente de recombinação HVT22.
A fim de ampliar o potencial de aplicação desse método, descrevemos a metodologia detalhada para a geração de recombinação vacina HVT expressa o gene VP2 de IBDV no locus UL45/46 neste relatório. A abordagem combina NHEJ-CRISPR/Cas9 para inserir o gene VP2 com gene repórter GFP e um sistema de Cre-LoxP para remover a fita de expressão de GFP mais tarde. Comparado ao tradicional recombinação e BAC recombineering técnicas, demonstramos que a NHEJ-CRISPR/Cas9 juntamente com um sistema de Cre-Lox é uma abordagem rápida e eficiente para gerar vacina recombinante HVT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:988px;" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">M199 medium, Earle&#39;s Salts</td>
			<td style="width:221px;">Life technology</td>
			<td style="width:163px;">11150059</td>
			<td style="width:235px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140148</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td>antifunigal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8782</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HVT Fc126 strain</td>
			<td>Avian Disease and Oncology Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>wildtype HVT virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pX459-v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #62988</td>
			<td>Cas9 and gRNA expression vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-T Easy Vector Systems</td>
			<td>promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>rR0547S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SfiI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0123S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-X2</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 6004</td>
			<td>transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture 6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td>junction PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum Pfx DNA Polymerase</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11708021</td>
			<td>PCR amplification of full insert</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica TCS SP5 LASAF</td>
			<td>immunoflourescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS cell sorter</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td>single cell sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (4% in PBS)</td>
			<td>Santa cruz biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30960</td>
			<td>permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing

Herpesvírus de perus (HVT) é um vetor viral ideal para a geração de vacinas recombinantes contra um número das doenças aviárias, tais como a gripe aviária (AI), doença de Newcastle (ND) e doenças infecciosas bolsas serosas (IBD), usando (cromossoma artificial bacteriano Mutagênese BAC) ou métodos convencionais de recombinação. O cluster regularmente intercaladas repetições palíndromos (CRISPR) / Cas9 sistema tem sido utilizado com sucesso em muitas configurações para edição de gene, incluindo a manipulação de vários genomas grandes vírus de DNA. Nós desenvolvemos um rápido e eficiente CRISPR/Cas9-mediada genoma edição pipeline para gerar recombinante HVT. Para maximizar o potencial de uso deste método, aqui apresentamos informações detalhadas sobre a metodologia de geração de HVT recombinante expressando a proteína VP2 de IBDV. A gaveta de expressão VP2 é inserida para o HVT genoma através um NHEJ (não-homólogos final-adesão)-caminho de reparação dependente. Uma gaveta de expressão de proteínas (GFP) fluorescência verde primeiro que consta a inserção para fácil visualização e em seguida removido através do Cre-LoxP sistema. Essa abordagem oferece uma maneira eficiente para introduzir outros antígenos virais no genoma da HVT para o rápido desenvolvimento de vacinas recombinantes.

A estratégia utilizada para a geração da vacina recombinante HVT é descrita na Figura 1, que inclui como o plasmídeo doador é construída (Figura 1A) e os procedimentos para gerar o HVT (Figura 1B recombinante ). Placas de GFP-positivo de cinco a trinta rodeadas por placas de tipo selvagem podem ser observadas no gene batendo-nos poços sob o posttransfection de 3-d de microscópio de fluorescência e - infecção. O vírus purificado obtido após a célula única classificação(Figura 2)foi analisada por 3' junção do PCR, que mostra um produto PCR do tamanho esperado (Figura 2A, painel inferior). Após a excisão do repórter GFP pela recombinase Cre, mais de 50% das placas perdeu sua expressão de GFP. A placa purificada após a excisão de GFP (Figura 2B), célula única classificando mais foi confirmada por 5' junção do PCR, que mostra o tamanho certo produto da PCR (Figura 2B, painel inferior). A Figura 3 mostra os resultados de sequenciamento de ambos junção produtos PCR com elementos coloridos diferentes. Na Figura 4, a expressão da proteína foi confirmada por IFA com anticorpo monoclonal específico de VP2 e anti-HVT frango soro. Como esperado, células infectadas com o HVT parental podem somente ser manchadas pelo soro anti-HVT (verdes), enquanto células infectadas HVT recombinantes mostraram claramente a expressão do gene VP2 (vermelho).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg"> Figura 1: estratégia para a geração de um recombinante HVT-vectored vacina. (A), este painel mostra uma representação esquemática da estratégia de clonagem para doador construção do plasmídeo. Os elementos chaves incluem dois sites de destino Cas9 (sgA) para liberar a inserção, uma gaveta GFP repórter ladeado com LoxP sequências para a excisão de GFP e a gaveta de expressão VP2. (B), este painel mostra uma visão geral de uma Two-Step gene knock-na estratégia. O fragmento de inserir o GFP e as fitas de expressão VP2 é lançado pela clivagem Cas9/sgA e inserido no genoma da HVT no UL45/46 loci através de NHEJ-CRISPR/Cas9. O vírus recombinante GFP-positivo é então classificado e purificado pela célula única fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação. Posteriormente, o gene repórter GFP é extirpado pela recombinase Cre e o vírus recombinante é purificado e caracterizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg"> Figura 2 : Verificação do HVT recombinante. (A) este painel mostra uma placa de GFP-positivo (HVT-GFP-VP2) visualizada sob o microscópio de fluorescência (painel superior) e a verificação de PCR de HVT-GFP-VP2 com primers VP2-F & UL46-R1 para a junção de 3'. (B) este painel mostra uma placa (HVT-VP2) visualizada após a excisão de GFP de HVT-GFP-VP2, usando recombinase Cre e verificação de PCR de HVT-VP2 com primers UL45-F1 e VP2-R1 para a junção de 5'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg"> Figura 3 : Sequência de análise do vírus recombinante HVT. (A) as sequências dos elementos-chave em diferentes cores neste painel são região intergênica HVT entre UL45/46 com a sequência de destino gRNA sublinhada e uma seta mostrando o local de clivagem Cas9, a gaveta de expressão VP2 com final sequências em minúsculas em itálico, a sequência do alvo do sg-A em vermelho com a seta mostrando o local de clivagem Cas9, a sequência do site LoxP em verde e duas sequências de sites de SfiI em azul. (B) este painel mostra os resultados de sequenciamento das junções de 5' e 3' e uma apresentação esquemática de HVT-VP2 com elementos-chave com cores correspondentes apresentadas em sequências. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg"> Figura 4 : Caracterização do recombinante HVT-VP2. Este painel mostra a confirmação da expressão bem sucedida do VP2 no CEFs infectados pelo teste de imunofluorescência indireta (IFA) com anticorpo monoclonal de anti-VP2 HH7 (vermelho). Infecção de HVT é confirmada por IFA com soro frango HVT-infectado (verde). Barra de escala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Geração de vetores recombinantes Herpesvirus aviária com CRISPR/Cas9 Gene edição

Herpesvírus de perus (HVT) é amplamente utilizado como uma plataforma de vetor para a geração de vacinas recombinantes contra um número das doenças aviárias. Este artigo descreve uma abordagem simples e rápida para a geração de vacinas recombinantes HVT-vectored, usando um sistema de Cre-Lox e integrado NHEJ-CRISPR/Cas9.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Esta abordagem oferece uma maneira eficiente de introduzir outros antígenos virais no genoma HVT para o rápido desenvolvimento de vacinas recombinantes. Alguma vantagem desta técnica é que um de expressão GFP é anexado à inserção primeiro para fácil visualização e depois removido pelo sistema Cre-LoxP. A mesma abordagem pode ser usada para inserir mais genes virais em diferentes locais do genoma HVT, ou outros vírus herpes aviários para o desenvolvimento de vacinas recombinantes multivalentes.Demonstrando o procedimento será Katy Moffat, uma especialista em triagem celular. Na Tang, Yaoyao Zhang e Guanggang Qu, cientistas do meu laboratório. Um dia antes da transfecção, preparem os fibroblastos de embrião de filhotes, conforme descrito no protocolo de texto.Semente 1,3 milhões de células em 2,5 mililitros de médio em cada poço de uma placa de seis poços. Transfeito as células CEF com 0,5 microgramas cada um dos dois plasmídeos RNA guia Cas9, e um micrograma do plasmídeo doador usando um reagente de transfecção apropriado de acordo com as instruções do fabricante. Incubar as células a 38,5 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 12 horas.12 horas após a transfecção dilui o estoque do vírus HVT com média de cultura M199 para uma concentração de 100.000 unidades formadoras de placas por mililitro. Adicione 130 microliters do vírus diluído a cada poço de células transfeinadas. Coloque um poço de células não traduzindo como um controle negativo e adicione a mesma quantidade de vírus.Incubar as células a 38,5 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três dias. Um dia antes da triagem, prepare duas placas de 96 poços semeando 20.000 células em cada poço. Três dias após a infecção recuperam as seis placas do poço contendo os CEFs transfectados e infectados.Aspire o meio de cada poço e enxágue a folha celular com PBS. Adicione um mililitro de 0,05% de trippsina-EDTA a cada poço e incuba as células a 38,5 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por aproximadamente cinco minutos. Em seguida, resuspengue as células com 50 microliters de FBS e transfira esta suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugar a 200 vezes a gravidade por cinco minutos. Resuspend as células em um mililitro de PBS contendo 1%FBS. Use um hemótmetro para contar as células e ajustar a densidade celular para um milhão de células por mililitro.Em seguida, transfira as células para um tubo de triagem de poliestireno através de sua tampa de coador. Usando um classificador de células, classifique as células únicas expressando GFP nas placas de poços de 96 semeadas. Incubar as placas com as células classificadas a 38,5 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco dias.Após cinco dias use o microscópio de fluorescência para verificar as 96 placas do poço e marcar os poços que contêm uma única placa positiva GFP. Trypsinize cada GFP positivo bem com 50 microliters de trypsin-EDTA por três minutos. Em seguida, adicione 50 microliters de cultura média para resuspensar as células e transferir esta suspensão para um poço de uma placa de seis poços com CEFs.Após três dias congele um frasco de cada uma das primeiras gerações de vírus recombinantes em meio de congelamento. Armazene esses vírus colhidos em nitrogênio líquido. Coletar 100.000 células de cada uma das primeiras gerações de vírus.Centrifugar as células a 2.000 rpm por cinco minutos, e descartar o supernatante. Armazene as células a 20 graus Celsius negativos até que estejam prontas para realizar a extração de DNA. Quando estiver pronto para realizar a extração de DNA use 50 microliters de tampão de squishing para descongelar e resuspensar as pelotas celulares.Lyse as amostras a 65 graus Celsius por 30 minutos e depois a 95 graus Celsius por dois minutos para inativar o Proteinase K.Executar uma reação pcr com três primers de junção principais usando um microliter de cada amostra de DNA como descrito no protocolo de texto. Carregue dois microliters dos produtos de amplificação para um poço de gel de 1%agarose para eletroforese gel. Para remover o gene GFP do vírus recombinante, use um reagente de transfecção para transfetar dois microlitadores de expressão de recombinase cre plasmid na placa de seis poços que foi pré-disseeded com células CEF.12 horas após a transfecção descongelam um frasco de vírus recombinante de nitrogênio líquido. Resuspenque suavemente o vírus e semee 50 microliters em cada poço de células transfeinadas, estabelecendo um bem como o controle negativo com a mesma quantidade de vírus. Incubar a 38,5 graus Celsius por três dias.72 horas após a infecção preparam as células para a classificação como descrito anteriormente. Classifique as células não fluorescentes únicas em uma placa de 96 poços pré-semeadas com CEFs. Em seguida, tentepsinizar as placas escolhidas e resususpensar as células correspondentes conforme descrito no protocolo de texto.Passe metade das células em cada poço de uma placa de 96 poços que foi pré-semeada com CEFs como a segunda geração. Centrifugar as células restantes de cada clone a 200 vezes a gravidade por cinco minutos. Descarte o supernascer e resuspenque as células com 50 microliters de tampão de esguicho para extração de DNA.Em seguida, execute o PCR com cinco primers de junção prime usando um microliter de modelo de DNA como descrito no protocolo de texto. Com base nos resultados do PCR, escolha de três a cinco clones positivos de HVT recombinante para novas passagens e verificação. Primeiro, infecte CEFs com a segunda geração de HVT recombinante em uma placa de 24 poços pré-semeada.48 horas após a infecção remover o meio de cultura e adicionar 500 microliters de 4% de paraformaldeído em PBS para corrigir as células. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova o fixador e lave a camada celular três vezes com PBS.Remova o PBS e adicione 500 microliters de 0,1% Triton X-100 para permeabilizar as células. Após 15 minutos, lave a camada celular três vezes com PBS. Adicione o buffer de bloqueio por uma hora para bloquear a vinculação inespecífica.Em seguida, diluir o anticorpo monoclonal anti-VP2 primário HH7 ou soro de frango infectado por HVT em um a 200 no tampão de bloqueio. Adicione 200 microliters do anticorpo primário diluído a cada poço e incubar à temperatura ambiente por uma hora. Lave a camada celular três vezes com PBS.Diluir o anticorpo secundário anti-rato de cabra IgG Alexa 568 ou anti-frango de cabra IgG Alexa 488 em um a 200 no tampão de bloqueio. Adicione 200 microliters de anticorpo secundário diluído a cada poço e incubar à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, lave as células três vezes com PBS.Use o microscópio de fluorescência para verificar a expressão proteica. Um dia antes da expansão do vírus, 2,6 milhões de células CEF em cada frasco T25. Descongele pelo menos três clones positivos e adicione um frasco de células ou vírus a cada frasco.Incubar os frascos a 38,5 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% até que seja observado um efeito citopático de 50%. Em seguida, colher as células em dois mililitros de meio de cultura. Infecte 50 microliters para um novo frasco T25 que foi pré-semeado com células CEF para a próxima geração.Continue recombinando o vírus recombinante por pelo menos 15 gerações. Usando PCR, analise cada geração de vírus para a presença da sequência VP2. O uso de um ensaio de imunofluorescência indireta analisa cada geração de vírus da expressão VP2.Após a triagem de células únicas, o vírus purificado obtido é analisado por três PCR de junção prime, que mostra um produto PCR do tamanho esperado. Após a excisão do repórter da GFP pela Cre recombina mais de 50% das placas perderam sua expressão GFP. A placa purificada após a excisão de GFP é obtida por classificação de célula única e é ainda confirmada por cinco PCR de junção prime que mostra produto do tamanho esperado.A expressão proteica é então confirmada pelo ensaio indireto de imunofluorescência com anticorpo monoclonal específico VP2 e soro de frango anti-HVT. Como esperado, as células infectadas com o HVT parental só podem ser manchadas pelo soro anti-HVT. Enquanto células infectadas por HVT recombinantes mostram claramente a expressão do gene VP2.Para gerar um vírus recombinante é necessária uma alta taxa de transfecção para maximizar a chance do vírus e a inserção para atender na mesma célula para a edição ocorrer. Após este procedimento, podem ser realizados experimentos em animais para avaliar a imunogenicidade e a eficácia das vacinas recombinantes. O desenvolvimento de novas vacinas vetoriais multivalentes usando a plataforma do sistema CRISPR/Cas9 descrita aqui será altamente benéfico para a indústria avícola para proteger contra múltiplas doenças avícolas.