感染症研究 (DZIF)、TTU 肝炎プロジェクト 5.807 5.704、ドイツ研究振興協会 (DFG) TRR179 のためのドイツの中心部から資金を受け取ったこの仕事 (TP 15) とオーストラリア HIV ・肝炎ウイルスの研究センター。
元の invPCR 法の開発と私たちにそれを示すことの彼の部分のため教授ウィリアムの石大工にお世話になっております。試薬 (細胞株および b 型肝炎接種) の両博士李 Ni とフロリアン A. Lempp に感謝したいと思います。我々 は、テクニカル サポートに博士カトリン ・ Schöneweis、サラ ・ エンゲルハルト ・ フランツィスカ ・ Schlund アニャ Rippert を認めます。校正、ミリアム Kleinig、教授ニコラス Shackel、ラルフ Bartenschlager の継続的な支援に感謝しております。

1. 細胞感染と DNA の抽出
<ol><li>培養 Huh7 おける NTCP 細胞8,9でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 胎児の牛血清 v/v、ペニシリン/ストレプトマイシンと 2 mM L グルタミン x 1 を維持します。 注: これは以前報告されて詳細40。</li>
	<li>種子 2 x 105セル/mL Huh7 おける NTCP セル DMEM の 1 ml 12 ウェル プレート。</li>
	<li>細胞治療 (例えば、 b 型肝炎ウイルス阻害剤) をテストする場合に適用する培養上清 4 h (HBV 感染前に 1 日) を播種後。否定的な制御の適用 200 nM Myrcludex B (強力な HBV エントリー阻害剤41)。</li>
	<li>500 μ L の培地 (v/v の 10% 牛胎児血清ペニシリン/ストレプトマイシン、2 ミリメートル L-グルタミンと 2.5 %v/v x 1 を DMEM で 1,000 VGE/セルの細胞へ感染する接種材料として HepAD3843から精製ヘパリン列42上清を使用します。DMSO) ポリエチレング 4 %w/v 8000 [1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 解散]。</li>
	<li>(5% CO2と 90% 湿度に設定) 37 ° C の定温器の細胞を培養します。</li>
	<li>感染 16-24 h 後に滅菌 1 × PBS の 1 mL で 2 回洗浄を行う。</li>
	<li>次の収穫まで HBV 感染 2 日ごと文化メディアを交換します。</li>
	<li>3 日目後感染で 5 μ M テノホビル テノホビルジソプロキシルおよび 10 μ M の細胞を扱うラミブジン無衝突 invPCR では、b 型肝炎ウイルス複製中間体の生産を制限します。</li>
	<li>5 日目感染後、トリプシン-EDTA の 200 μ L でセルを trypsinize、DMEM (10 %v/v 胎仔ウシ血清、ペニシリン/ストレプトマイシンと 2 mM L グルタミン x 1)、また、5 μ M テノホビル テノホビルジソプロキシルと 10 μ M を含む 2 mL でそれらを再懸濁しますラミブジン。</li>
	<li>細胞懸濁液を細胞分裂 (これは invPCR によって HBV cccDNA44と無衝突が他の HBV DNA の中間物の損失を誘発すると報告されている) の 1 つのラウンドを誘発する 6 ウェル プレートに転送します。</li>
	<li>7 日目感染後、トリプシン-EDTA の 400 μ L で拡張された細胞を trypsinize、DMEM の 1 mL に混合物を再懸濁します。懸濁液を 1.5 mL チューブに、5 分間 500 × g で遠心分離によって細胞をペレットし、吸引により、上清を除去します。</li>
	<li>(省略可能)DNA の抽出の準備ができるまでは、-20 ° C で細胞ペレットを格納します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、DNA 抽出キットを使用して細胞ペレットから DNA を抽出します。光学密度測定を使用して最終的な DNA 濃度を推定します。 注: 100 μ L の溶出量の DNA 収量は一般的に 250 〜 400 ng/μ L。</li>
</ol>2. DNA の逆転
<ol><li>200 μ L の PCR チューブにステップ 1 から全 DNA の分注 ~1.5–2.5 μ g を抽出します。1 x ダイジェスト反応バッファーを含む 40 μ L 反応ボリュームが発生する制限酵素マスター ミックスの適切な量を追加 (e.g。、CutSmart バッファー) と 10 U下士官私-HF。</li>
	<li>反応を徹底的にミックスし、小さな管、遠心分離機でスピンダウンします。37 ° C で最適な消化効率のために 1 時間の PCR マシンに制限酵素反応を孵化させなさい。</li>
	<li>20 分の 80 ° c の孵化によって制限酵素を不活性化します。</li>
	<li>1.5 mL チューブに全体の制限酵素反応を転送します。T4 DNA リガーゼ バッファーと 500 U の T4 DNA リガーゼ x 1 の 400 μ L を追加し、それを徹底的にミックスします。大きな反応量は、消化の DNA のフラグメントの (反対分子間) 分子内結紮を奨励しています。</li>
	<li>完全な結紮を確実に 2 時間室温で ligation の反作用を孵化させなさい。</li>
	<li>70 ° C、20 分で T4 DNA リガーゼを不活性化します。</li>
	<li>T4 リガーゼの完全な不活化を確保するためドデシル硫酸エステル ナトリウム 10 %w/v の 10 μ L を追加します。</li>
	<li>パルス ボルテックス チューブをミックスし、反応混合物を簡単にスピンします。100 mM とデキストラン (35-45 kDa) の最終的な集中に NaCl を 90 μ g/mL の最終的な集中に追加します。パルス ボルテックス チューブをミックスし、反応混合物を簡単にスピンします。</li>
	<li>逆解析による 900 μ L の 100% エタノールとミックスを追加します。一晩、-20 ° C で DNA を沈殿させます。</li>
	<li>ペレットで 14,000 x g で 15 分間の遠心分離で沈殿した DNA は、P200 ピペットで吸引により上清を削除します。15 分 14,000 x g で 70 %v/v エタノールおよび遠心分離の 500 μ L の餌を洗浄します。</li>
	<li>P200 ピペットで吸引してエタノールを削除します。20 分間室温で DNA の餌を風乾します。</li>
	<li>溶解ダイジェスト反応バッファー × 1、 BsiHKAI の 5 U と 5 U Sph- HF. 加温を含む 40 μ L 反応量の結果をマスター ミックス制限酵素の H2O を追加 20 μ L の 20 μ L でペレットに制限酵素反応、37 ° C ( SphHF 最適温度) 1 h でヒート ブロック。</li>
	<li>反応混合物を簡単にスピンします。65 ° C ( BsiHKAI 最適温度) 1 h でヒート ブロックに制限酵素反応を孵化させなさい。</li>
	<li>反応混合物を簡単にスピンします。</li>
	<li>次のステップまで-20 ° C で倒立の DNA を格納します。</li>
</ol>3. nested pcr 法
<ol><li>DNA 劣化ソリューションを使用して再利用可能なシリコン マット シールから潜在的な産物を削除、徹底的に DNA 無料水でマットを洗い、PCR の混合物を準備しながら室温でそれを空気乾燥します。</li>
	<li>外側前方を含む 1 x PCR ミックス 1 mL を準備 (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3') および逆引き (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') 0.5 μ M の濃度でプライマー。</li>
	<li>A1 と E1 の井戸 96 ウェル PCR プレートに 1 x PCR ミックスの 170 μ L を追加します。</li>
	<li>H1 に井戸 B1 に 1 x PCR ミックスの 120 μ L を追加します。</li>
	<li>A1 と E1 の井戸にステップ 2 から逆の DNA の 10 μ L を追加 (同じ PCR プレートには 2 種類の反転サンプルを分析できます)。ミックス各約 10 倍を軽くピペッティングによる各ウェルに反応は、100 μ L に設定 P1000 を使用しています。</li>
	<li>連続希釈サンプルは、A1 D1 からを 1:3 の割合で各ステップで 60 μ L を転送することによって井戸します。優しくそれらを 100 μ L に設定 P1000 を使用して 10 回のピペッティングにより各ステップで井戸をミックスします。気泡を形成しないでください。よく H1 まで希釈も E1 の手順 3.6 を繰り返します。</li>
	<li>96 ウェル プレートの A12 H12 井戸に到達するまでに井戸 A2 H2、H3-A3 に井戸 A1 H1 からマルチ チャンネル ピペットを使用する反応液の分注 10 μ L。ステップ 3.1、しっかりと押してから乾燥シリコン マット PCR プレートをカバーします。</li>
	<li>PCR マシンでプレートを置き、次のプログラムを実行: 95 ° C で 10 分間15 35 サイクル 95 ° c、15 s s 54 ° C、72 ° C、3 分72 ° C で 7 分その後、室温でプレートを保持します。</li>
	<li>ブンゼン バーナーで真っ赤に 96 ピン レプリケーターのピンを加熱し、室温で少なくとも 5 分間冷却します。</li>
	<li>1 x PCR ミックス (ゲル負荷用バッファーを含む) と内側の前方の 10 μ L を第 2 PCR プレートの井戸を埋める (5'-CGC ATG ギャグ ACC ACC GTG A-3') および逆引き (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') 0.5 μ M で。</li>
	<li>慎重に最初のラウンド PCR から 96 ウェル プレートの PCR プレートからシリコン マットを削除、井戸間の交差汚染を避けます。</li>
	<li>第 1 ラウンドの PCR から新しく検体の 96 ウェル プレートに 96 ウェル プレートの PCR の製品を転送するのに冷却のレプリケーターを使用します。Nested pcr 法のステップ 3.8、95 ° C で初期変性のステップを 10 分から 2 分に変更する以外同じ条件を使用して実行します。</li>
</ol>4 PCR 製品分離とゲルの抽出
<ol><li>96 ウェルを用いた 1.3 w/v アガロースゲル電気泳動で PCR の製品を分析します。100 mL agarose のゲルを 10-15 分の 200 V で実行します。</li>
	<li>使い捨てストローを使用して agarose のゲルからの DNA バンドを切除します。各 PCR の製品のわらを置き、agarose のゲルを 1.5 mL チューブに差し込み、サイズにわらをハサミでトリミングします。 注: 単一の PCR の製品を解決できるこれらの希釈からだけのバンドを分離するで十分です。</li>
	<li>(省略可能)後で抽出するための-20 ° C でチューブを格納します。</li>
	<li>各チューブにわらのフラグメントの端に押し込んでアガロース プラグを取り出します。各チューブにゲル抽出バッファーの 300 μ L、5 μ L のゲル抽出ガラス ビーズ スラリーを追加します。</li>
	<li>(半分ボリュームを使用して、手順を洗浄するため) を除くゲル抽出キットの製造元の指示に従って PCR の製品を抽出し、30 μ L の水とビーズから DNA を溶出します。</li>
	<li>サンガーの浄化された DNA を提出と 2 番目のラウンドで使用される前方のプライマー (仕入先の指示) に従ってシーケンス ネスト PCR。</li>
</ol>5. シーケンス解析
<ol><li>ブラストと塩基配列 (全体ヌクレオチド コレクションへの位置合わせの既定の設定を使用) を実行することによってウイルス細胞の DNA 結合部位を確認します。 注: 代表的な結果は以下の図 3で詳しく説明します。<ol>
<li>高炉解析を再実行する前に 5' HBV dna シーケンスの部分の配置を観察すると、場合にのみをトリミングします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>特定のシーケンスは次のように真の統合ジャンクションを表すかどうかを確認する厳格な選択基準が適用されます。<ol>
<li>だけが含まれるシーケンスを含む > 20 細胞のゲノムにマッピングを自信の細胞シーケンスの bp。</li>
		<li>10 はずのウイルス-細胞統合ジャンクション、彼らの可能性を表す体外結紮イベントとしての bp ではなく真の統合ジャンクション内で使用されるすべての酵素の制限のサイトを含むシーケンスを無視します。</li>
		<li>シーケンス反応中に交差汚染によって生成された可能性が高い成果物は、これらシーケンス クロマト グラフになって統合ジャンクションのどちら側に明らかな異種ピーク蛍光レベルの任意のシーケンスを無視またはキャピラリー クロマトグラフィー。</li>
		<li>これらの正確な b 型肝炎ウイルスとウイルス細胞接合部で細胞のシーケンスとして独自の統合イベントを定義します。 注: 独自の統合イベントの繰り返しに起因できる PCR (の代表の結果にさらに詳細なネガティブ コントロール反応を使用してテストすることができます中にこれらの統合や相互汚染を含む細胞のクローン性増殖下記参照)。特定の細胞系列に繰り返し統合は、非相同末端結合経路が使用される15統合イベントごとに異なる HBV ターミナル サイトを表示する予定です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>反転反応に総 DNA の入力の量に正規化が続いて、その希釈で検出されたウイルス細胞ジャンクションの数による倒立 DNA テンプレートの希釈倍率を掛けて統合周波数を計算します。一般的に、統合周波数は 1:10 程度は4セル。</li>
</ol>

思慮は、共同出願人と HBV/HDV 侵入阻害剤として Myrcludex B を保護する特許の共同発明者です。技術移転は、利害の対立を宣言していません。

プロトコルを実行する前に、この invPCR 試金が機密性の高い技術、DNA のテンプレートの単一コピーを増幅できることに注意してくださいすることが重要です。そのため、PCR の製品からの汚染を制限する非常に重要です。PCR の製品の汚染を制限する一般的な方法は次のとおりです。(i) 方法の異なるステップの物理的に独立した領域を確立します。各領域別の白衣が必要し、これらの領域間を移動するとき、手袋を変更する必要があります。我々 は少なくとも可能性が高い汚染される最もから順に以下のこれらの領域を記載している: PCR 製品抽出とシーケンス反応セットアップ エリア (ポスト PCR);PCR テンプレートと燃え上がったピン転送領域 (我々 は良い結果を UV ランプを擦りあわせる PCR フードを使用している)。DNA 抽出、反転領域 (前 PCR);株式および PCR ソリューションを準備するためにのみ使用「DNA テンプレート無料」エリアです。(ii) のクロス汚染の潜在的なドライバーとしてラボで空気の流れに注意してください。特に、燃え上がるピン転送段階の PCR の反作用のクロス汚染が発生する最も可能性の高い統合周波数の不正確な定量化につながる。PCR のフードを使用して、これらのクロス電流を制限できます。PCR のネガティブ コントロール井戸 (例えばMyrcludex B 処理サンプルやテンプレート コントロールなし) は、クロス汚染をテストするも使用できます。(iii) ピペットに潜在的な PCR の汚染物質を制限し、定期的に DNA 分解の解決によってそれらを拭くことによって作業面。
ここで指定したプロトコルは、HepAD38 のセル行42から生成された知られている伝染性 HBV クローンの統合を検出する配置されます。使用菌は別の HBV DNA シーケンス (例えば、患者血清から) では、PCR のプライマーおよび反転デザインの互換性を確認して最初 HBV ゲノムに配列されるべきであります。以前に発行された研究19の HBV DNA の統合の接合の予想されるサイトの側面の保存された HBV DNA 配列をバインド プライマーの 3 セットを使いました。その他のプライマー シーケンス プロトコル HBV44,45,46,47,48のゲノム配列の決定に記載されているし、正常に動作可能性があります。
さらに、異なる HBV 感受性細胞 (例えば、ひと肝細胞、分化 HepaRG HepG2 おける NTCP 細胞) を使用できます。しかし、我々 はウイルスの中間 DNA が増幅された13と比較して増幅される DNA 接合ウイルス細胞の数を考慮したとき、解決 Huh7 細胞が最大の信号対雑音比を提供することを発見しました。特に、最終分化細胞ひと肝細胞、分化 HepaRG など効率的に行われていない有糸分裂、無衝突 HBV DNA 複製中間体細胞内で残りの高レベルで、その結果します。我々 は、増幅されたシーケンスの ~ 90% を表す HBV DNA の再編成・統合イベントではなく最終分化細胞の肝癌細胞ライン1370-50% と比較を発見しました。これらの製品は、一般的に表面・ コアの開いたリーディング ・ フレーム、大きな欠失を含む HBV DNA ゲノムまたは彼らは私の前に私はサイトSphサイト追加下士官HBV 準種を表すことができます。(回路図を含む) これらの b 型肝炎ウイルス種の増幅に記載されている詳細以前13。
このメソッドのいくつかの欠点があります。このプロトコルの骨の折れると複数日性質のため invPCR はサンプルの大規模な数のハイスループット解析には適していません。さらに、それは希釈滴定の制限に依存する、本手法は定量化; で高精度それは簡単に統合周波数のログ レベルの変更を測定する必要があります。
さらに、私達の反転のプロトコルのみ HBV インテグレーションの大半はこの地域49内で発生する HBV ゲノムの DR1 と DR2 の地域間の統合を検出するために適しています。B 型肝炎患者組織の NGS 解析が大きい少数を示すこの地域49外 (~ 50% まで) があります。InvPCR の新しいデザインがされていない (知識) に理論的にこれらの他の統合サイトを検出することができるまだ遂行。関連して、反転反応ウイルス セル接合順序から下流に必要な必要な制限酵素サイト、invPCR 検出されません HBV ゲノムの DR1 と DR2 の領域内で発生するすべての統合 (すなわち、我々予想している全モジュールの ~ 10%、インシリコシミュレーション13を使用して検出)。しかし、さまざまな治療法の少数のサンプルの集中バッチに適用されると、invPCR は単一塩基対の解像度で統合された b 型肝炎ウイルス DNA を検出するための唯一の実用的な方法の 1 つであります。
したがって細胞 (ノックアウトまたは特定の細胞遺伝子の過剰発現、または様々 な薬のアプリケーション)、および環境 (ウイルス (b 型肝炎接種の突然変異)、経由を見つけることに重要な役割を提供このメソッドのアプリケーションを思い描いてください。例えば、酸化ストレスへの暴露) HBV DNA の統合を誘発する要因。このメソッドと新しく開発された HBV 感染システムより良い特徴とよく分離できるので、これらの要因の前例のないコントロールを有効にします。またこれは HBV DNA の統合は、この式をコントロール、統合されたフォームからどの程度のウイルス抗原 (例えば、 HBx または HBsAg50) を表明するなどの細胞の結果のキーの理解につながることを期待します。HBV 統合が大幅よりプロ発癌状態の方の細胞の表現型を変更するかどうか。これらの今後の研究の結果では、B 型慢性肝炎の治療に使われる治療戦略とウイルス自体の基本的な理解、深い影響があります。

B 型肝炎は、肝硬変や肝細胞癌 (HCC)1,2,3につながる生涯の慢性的な感染症を引き起こす可能性が二本鎖 DNA ウイルスです。中運転 HBV 持続性4 (例えば、エピジェネティックなウイルス転写テンプレートの高安定性)、免疫監視の回避、肝臓で肝細胞の離職率は低いとそれに関連付けられた複数の分子メカニズムリスク HCC 開始5,6 (例えば、慢性的な炎症と応力経路細胞の活性化)、HBV DNA の統合ホスト細胞のゲノム (これらの現象の両方のための報告されたメカニズム) を不十分に研究されています。.適切な培養感染システムの HBV の統合イベントの確実な検出ができる不足している主な理由。ここでは、体外生成の分子機構とその結果を明らかにする使用ことができます HBV DNA の統合の検出最近開発されたプロトコルについて述べる。
B 型肝炎ウイルスの複製と HBV DNA の統合の形成は、以前詳細7に検討されています。簡単に言えば、HBV 感染8,9の主な細胞受容体としてナトリウム タウロコール酸 Co-transporting ペプチド (解決) を用いた肝細胞に入る。HBV リラックスの環状 DNA (rcDNA) を含む b 型肝炎ウイルスのヌクレオカプシド ゲノム episomal 共有閉環状 DNA (cccDNA) に、rcDNA の変換、核に入る。核 cccDNA はウイルス Mrna とあらかじめゲノム RNA (pgRNA)10の転写のテンプレートとして機能します。B 型肝炎ウイルスのポリメラーゼおよび pgRNA は、新しく形成されたヌクレオカプシド (HBV コア蛋白質二量体で構成される) にパッケージ化します。B 型肝炎ウイルスの pgRNA は rcDNA ゲノムや二本鎖線形 DNA (dslDNA) ゲノム11,12の結果から内逆転写です。HBV DNA のゲノムを含んでいるこれらの成熟したヌクレオカプシドは最後にエンベロープを付け、ウイルス粒子としてエクスポートします。
DslDNA 分子を含むエンベロープの粒子によって肝細胞の感染ウイルスの統合ホスト細胞ゲノム13、HBV DNA7,14,15の複製無能なフォームにつながる可能性があります。HBV DNA の統合は、染色体の二重鎖 DNA 改15のサイトで発生しました。証拠の蓄積には、各統合イベントがホスト細胞ゲノム16,17の内で本質的にランダムな位置に発生することが示唆されました。さらに、HBV DNA の統合は起こる幾分稀、1 104細胞13,18,19,20あたりの速度に。HBV DNA の統合に関する重要な質問は特に正確なの分子経路関係、依存性ウイルスと宿主因子、統合されたフォーム、および彼らの可能な貢献から発現するウイルス抗原について未解答に、残る。ウイルスの永続性の7。これらの質問のいくつかの光を当てることの in vitroモデルを設けています。
HBV 感染の in vitroでの HBV DNA 統合イベント (レートの統合セルごと、それぞれのユニークな統合のコピー数に関して両方) の希少性は、それらを検出するために挑戦するをモデル化します。分裂細胞の効率的な感染をサポートしていない、私たちの in vitroシステム細胞分裂が限られます。したがってとは異なり、肝細胞のクローン性増殖の重要な18,19、を発生する患者の肝組織内における20、各統合の数 (1、2) コピー セルの特定のプールに存在している非常に感染体外.また、統合が初期感染肝細胞 (そして継続的に慢性的に感染した肝細胞の)13時に主に発生することを発見しました。したがって、HBV DNA の統合は、単に長い期間の細胞を培養して増やすことができません。
一般に、以前南部を含む、統合の HBV DNA の検出に使用するメソッドのしみの交配21,22,23,24,25, Alu PCR26,27、カセットを介したライゲーション PCR28と29,30,31,32,33, シーケンス処理全体のゲノムを検出する感度はありません統合の単一コピー。我々 と他の研究者が使用している逆に、アヒル、ウッド チャック、人間感染肝臓13,14,18,19、hepadnaviral DNA の統合を検出する PCR (invPCR) が入れ子になった 34,35,36。他の人は偽陽性信号の生成を変更し、定量化37の能力を制限する可能性があります invPCR テクニックを手続きの変更を導入しています。このプロトコルで説明されているように、分析が実施 invPCR は特定および敏感な試金を識別し、定量化 (絶対コピー数) で複数の HBV DNA の統合を表します。B 型肝炎ウイルス細胞の DNA 接合は基づくウイルスの研究を許可する単一塩基対の解像度でシーケンシャルなホスト DNA シーケンス統合13のサイトで。
前述した invPCR から38結果スナップ冷凍肝組織、パラフィンの肝臓切片によって分離された非常に小さい組織サンプルを含むソースの広い範囲から抽出した DNA の HBV 感染組織レーザー レーザーマイクロダイ セクション19。このプロトコルは生体外で感染、インテグレーション (統合あたり 1-2 コピー) の低コピー数が生成されます後細胞培養組織から抽出した DNA を使用して invPCR の試金の更新されたバージョンをについて説明します。HBV DNA 形成の統合、体外細胞ゲノムと統合13,16、ウイルス シーケンス内でジャンクションの分布に関して患者の組織で見つかったものに似てを示唆、感染した肝内に匹敵する経路。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO for spectroscopy</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS021622</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamivudine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1295</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (35 -45 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1662-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiHKAI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0570L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold Taq kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331816</td>
			<td>Use for first nest PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>2239442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6509 SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin replicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi PCR kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection

B 型肝炎ウイルス (HBV) は、肝臓がんや慢性感染症に起因する肝硬変を引き起こす一般的な血液媒介病原体です。ウイルスは一般的に中間;、episomal DNA を複製します。ただし、HBV DNA のフラグメントのホストのゲノムに統合を観察されている、にもかかわらず、このフォームはウイルスの複製の必要はありません。正確な目的、タイミングと言い、HBV dna の統合が発生しますが、まだ明確なしかし最近のデータが感染後非常に早いが発生することを表示します。ここでは、体外発生と HBV DNA の統合の検出は、詳細に説明します。私達のプロトコルは特にウイルス細胞の DNA の統合の単一コピーを増幅し、絶対定量とジャンクション シーケンスの単一塩基対解像度の両方が可能します。HBV 変異、および様々 な薬剤のエクスポー ジャーと組み合わせて、さまざまな HBV 感受性細胞種類 (プライマリひと肝細胞を含む) にこの手法は施してあります。我々 はこの臨床的に関連する現象の分子メカニズムを決定するキーの試金になるこの手法を予見します。

InvPCR 技術の概略は図 1に示します。PCR 製品分離前後に成功した invPCR の例の agarose の泳は図 2に示すです。図 3は、HBV DNA 複製中間体のウイルス細胞 DNA 接合の増幅 (i) と (ii) 増幅の場合 5.1 ステップからブラスト分析の出力を示します。
ポジティブ コントロールから結果を期待: Huh7 おける NTCP 細胞 (図 1) を上記のようにヘパリン精製した HBV の株に感染してポジティブ コントロールとして使用できます。このインスタンスで (図 2希釈あたり 10 ~4セル同等に対応) 各サンプルの 2 番目または 3 番目の 1:3 希釈による単一の PCR の製品を達成べきであります。これらの希釈で製品の約 50% は他の半分は、HBV DNA 中間体 (図 3) の増幅に真のウイルス細胞 DNA 接合を表します。
以前研究13、繰り返しウイルス細胞接合、優遇の HBV DNA の統合の細胞ゲノム部位がないことを示すほとんどのインスタンスが します。我々 は、ウイルス細胞接合の>80% が、後者は HBV の dslDNA フォームの右側の末端を表して 1732、(ヌクレオチドの番号 HBV ジェノタイプ D、GenBank 加盟 #U95551.1)、に従って 1832 のヌクレオチドの間もあります。真のウイルス細胞接合の in vitroの実験で本手法によって発見のシーケンスは、GenBank (加入番号 MH057851 MH058006) で公開。
期待される否定的なコントロールから結果: Huh7 おける NTCP 細胞を感染または Huh7 おける NTCP を接種した細胞 Myrcludex B と前処理ネガティブ コントロールとして使用できます。これらの細胞から抽出した DNA の InvPCR 解析は PCR の製品をもたらす必要があります。ネスト PCR プロセス中に交差汚染のテスト肯定的なサンプルとして同じ PCR プレートにこれらの否定的なコントロールのサンプルを実行することができます。交差汚染の最も厳しいテストは井戸 A ~ D の否定的な制御サンプルとウェルズ E H 96 ウェル プレートで肯定的なサンプルの実行です。この場合、肯定的なサンプルの最も高濃度の希釈は、否定的なサンプルの少なくとも濃縮希釈に直接隣接する行で実行されます。拡大の製品は、マイナス コントロールのサンプル観察される、協会のクロス汚染のでき事を最小限に抑えるための議論で提案した手段を実行します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> 図 1: HBV DNA の統合を検出する invPCR プロセスの概略図です。HBV 感染、Huh7 おける NTCP セルの少数を含む HBV dslDNA (赤) (赤) のホスト細胞のゲノムに統合されて後は、上部に描かれています。全 DNA 細胞 (手順 1) から抽出した、(手順 2) を反転し、(ステップ 3) 入れ子になった PCR によって増幅します。制限酵素サイトの相対的な位置を示す (下士官私とBsiHKAI) 切除ウイルス細胞 DNA ジャンクションに。図は、以前の文書13から適応。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> 図 2: Agarose のゲルの電気泳動および成功した invPCR の後続のゲルの抽出します。"M"は、DNA のマーカーの梯子を表します。12 の各行は、単一希釈 PCR プレート上で技術的なレプリケートを表します。PCR プレート/agarose のゲルあたり 2 つの逆にされた DNA サンプルを実行できます。各希釈用 PCR の製品する必要があります 〜 1 を滴定: 3 比。限界希釈法によって HBV DNA の統合の率を定め製品の単一のバンドが簡単に分離することができます 2 つの少なくとも濃縮希釈抽出で一般的に十分です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> 図 3: invPCR 製品系列の高炉解析します。シーケンスの長い管はサンガー シーケンスのソースから生成される DNA シーケンスは一般的にあいまいではないです。B 型肝炎ウイルスと細胞のゲノムに厳密な位置合わせはサンガーから生成された FASTA シーケンス ファイルのさまざまな領域で観察される真のウイルス細胞 DNA 接合を示唆、上部パネルでシーケンスします。下部のパネルにシーケンスを並べ替え HBV DNA ゲノムの増幅によって生成された製品を示唆している HBV ゲノムの断片にのみ配置します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

我々 はここで B 型肝炎ウイルス感染システムを介して HBV DNA の体外生成を記述して、逆行列を用いて、(1-2 コピー) 統合の高感度検出に PCR が入れ子になった。

低コピーの検出数は B 型肝炎感染培養によって形成された統合ウイルス DNA

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

この方法は、HPV DNAの統合に影響を与える細胞またはウイルス学的要因を見つけるなど、B型肝炎ウイルス学の主要な質問に答えるために使用することができます。この手法には複数の利点があります。比較的安価で実行が簡単で、結果の分析は簡単で、非常に機密性が高く、単一のコピーまでです。この方法はHBV統合に関する洞察を提供するために使用することができますが、HIV、HTLV-1、HPVなどの宿主細胞ゲノムに統合する他のウイルスにも使用できます。細胞に感染するには、12個のウェルプレートに1ミリリットル当たり200,000個の細胞を、D-memを1ミリリットルで種付けする。翌日、ヘパリンカラムを用いて、HEP-AD 38から精製されたsu-per-na-dinを接種剤として使用し、細胞あたり1,000 VGE、500マイクロリットルの培養培地で細胞に感染させる。次に、セルを摂氏37度で培養します。次の日に、細胞を1ミリリットルの無菌PBSで2回洗浄する。次いで、収穫まで2日毎に培地を交換する。3日目のポスト感染時に、5ミクロモルテノホビルジソプロキシルおよび10ミクロモルラミブジンで細胞を治療し、逆PCRによって増幅可能なHBV複製中間体の産生を制限する。5日目、ポスト感染は、トリプシンEDTAの200マイクロリットルで一部の細胞をトリプシン化し、5ミクロモルテノホビルジソプロキシルと10ミクロモルラミブジンを含むD-memの2ミリリットルでそれらを再中断する。続いて、細胞懸濁液を6つのウェルプレートに移し、1ラウンドの有糸分裂を誘発する。7日目のポスト感染では、400マイクロリットルのトリプシンEDTAで膨張した細胞をトリプシン化し、D-memの1ミリレターで混合物を一時停止する。その後、懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。ペレットは、500回Gで遠心分離により細胞を、5分間用いた。そして、願望によってSu-per-na-dinを取り除く。メーカーの指示に従って、DNA抽出キットを使用して細胞ペレットからDNAを抽出します。DNA反転の場合は、全DNA抽出物の1.5~2.5マイクログラムを200マイクロリットルPCRチューブに割り当てます。次に、適切な量の制限酵素マスターミックスを加えて、40マイクロリットルの反応量を生じ、1回の消化反応バッファーと10単位NCO-1HFを含有する。PCRマシンで制限酵素反応を摂氏37度で1時間インキュベートし、最適な消化効率を実現します。次いで、摂氏80度を20分間インキュベートして制限酵素を不活性化する。制限酵素反応全体を1.5ミリリットルチューブに移します。続いて、400マイクロリットルのT4 DNAリガーゼバッファーと500単位のT4 DNAリガーゼを加え、十分に混合する。大きな反応量は、消化されたDNA断片の分子内結紮を促進する。完全な結紮を確実にするために、室温で2時間のライゲーション反応をインキュベートする。2時間後、T4DNAリガーゼを摂氏70度で20分間不活性化する。次に、10マイクロリットルのドデデデシル硫酸ナトリウムを加えて、T4リガーゼの完全な不活性化を確実にする。100ミリモルの最終濃度に塩化ナトリウムを加え、1ミリリットル当たり90マイクログラムの最終濃度にデキストランを加えます。パルス渦によって混合し、反応ミックスを短時間回転させます。次に、900マイクロリットルの100個のエタノールを加え、反転して混ぜます。一晩で20°Cの負の20度でDNAを沈殿させる。そして14000倍Gで遠心分離により沈殿したDNAを15分間ペレットとした。その後、吸引でスー・パー・ナ・ダインを取り除きます。ペレットを500マイクロリットルの70個のエタノールで洗います。15分間Gの14000倍で遠心分離を行う。その後、吸引によりエタノールを除去し、室温で20分間空気乾燥した。ペレットを20マイクロリットルの水に溶解し、20マイクロリットルの制限酵素マスターミックスを加えて、1回の消化反応バッファー、5単位BSIHK-1、および5単位のSPH-1HFを含む40マイクロリットルの反応量を生じる。巣、摂氏37度のヒートブロック内で制限酵素反応を1時間インキュベートする。反応ミックスを短時間スピンダウンし、摂氏65度のヒートブロックで制限酵素反応を1時間インキュベートする。この手順では、DNA分解溶液を使用して、再利用可能なシリコンマットシールから潜在的なアンプリコンを除去します。マットをDNAフリーの水で十分に洗い流し、室温で空気乾燥させます。次に、0.5マイクロモルの濃度で外側前方および逆プライマーを含有するPCRミックスを1回1ミリレターで調製する。1回PCRを1回混合した場合は170マイクロリットルをウェルA-1とE-1に、96ウェルPCRプレートに加えます。次に、1回のPCRミックスの120マイクロリットルをウェルB-1とH-1に加えます。その後、10マイクロリットルの逆DNAをウェルA-1およびE-1に加える。各ウェルに反応を混ぜ、各ウェルを軽くピペット化し、P-1000を100マイクロリットルにセットして約10回使用する。各ステップで60マイクロリットルを移すことによって、ウェルA-1からD-1までのサンプルを1:3の比率で連続して希釈します。P-1000を100マイクロリットルに設定して約10回軽くピペット処理して、各ステップで井戸を混ぜます。泡を形成することを避け、よくE-1の手順を繰り返し、よくH-1に希釈する。続いて、反応混合物の10マイクロリットルを割り当て、マルチチャネルピペットを使用して、ウェルズA-1、H-1から、ウェルA-2、H2、A-3、H-3および同様に、96ウェルプレートのウェルA-12、H-12に達するまでウェルA-2、H-3、および同様に。PCR プレートをドライシリコンマットで覆い、しっかりと押します。次に、プレートをPCR機に入れ、示されたプログラムを実行してから、プレートを室温に移します。その後、96ピンレプリケータのピンをブンゼンバーナーで赤熱し、室温で少なくとも5分間冷やします。2番目のPCRプレートのウェルを10マイクロリットルのPCRミックスで満たし、ゲル負荷対応バッファを含み、内側の前方および逆を0.5マイクロモルで充填します。第1ラウンドPCRから96ウェルプレートのPCRプレートからシリコンマットを慎重に取り除き、ウェル間の交差汚染を避けてください。冷却されたレプリケータを使用して、最初のラウンドPCRから新たに割り当てられた96ウェルプレートに96ウェルプレートのPCR産物を移します。示された条件を使用して、ネストされたPCRを実行します。PCR産物を分離するには、1.3アガロースゲルを用いて96ウェルプレートを使用して、ゲル電気泳動で分析します。100ミリリットルのアガロースゲルの場合、200ボルトで10〜15分間実行します。その後、使い捨ての飲みストローを使用して、アガロースゲルからDNAバンドを切除します。PCR製品ごとに、ストローとアガロースゲルプラグを1.5ミリリットルチューブに入れ、ストローをハサミでサイズにトリミングします。その後、ストロー断片の端部を絞って、アガロースプラグを各チューブに排出します。次に、300マイクロリットルのゲル抽出バッファーを加え、各チューブに5マイクロリットルのゲル抽出ガラスビーズを加えます。ゲル抽出キットのメーカーの指示に従って PCR 製品を抽出し、ビーズから 30 マイクロリットルの水で DNA を希釈します。第2ラウンドのネストPCRで使用されるフォワードプライマーを使用して、サンガーシーケンシング用に精製されたDNAを提出します。PCR産物の分離前後に成功した逆PCRのアガロースゲル電気泳動の例を示します。Mは後者のDNAマーカーを表し、12の各行は、PCRプレート上の単一希釈時の技術的複製を表す。この場合、単一PCR産物は、各サンプルの2番目または3番目の1:3希釈によって達成されるべきである。これらの希釈では、製品の約50%が真のウイルス細胞DNA接合を表します。一方、残りの半分はHBV DNA中間体の増幅を表す。この技術により、研究者は高度に制御されたインビトロ感染システムにおけるHPV DNAの統合を探求することができました。バイオテマティクス分析などの追加の方法を使用して、さらなる質問に答えることができます。例えば、HPV DNAの統合が細胞ゲノムの特定の領域で起こる場合がある。感染B型肝炎ウイルスを扱うことは、危険で適切な感染制御であり得る、バイオ安全キャビネットおよび事前ワクチン接種は、これらの手順を実行している間、常に取られるべきであることを忘れないでください。