연구 결과는 국립 과학 센터에 의해 재정적으로 지원되었다, 폴란드 (부여 없음. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) 및 KNOW (주요 국가 연구 센터) 과학 컨소시엄 "건강한 동물 - 안전한 식품", 과학 고등 교육부의 결정 No. 05-1/KNOW2/2015

1. 문화유지
<ol><li>유지 보수 매체에서 P19 세포주 배양 (Dulbecco의 수정 된 독수리의 배지와 4,500 포도당 의 mg /L 보충 10% FBS, 100 단위 / mL 페니실린 과 100 단위 / mL 연쇄상 구균). 37 °C 및 5 %CO2에서 배양하십시오.</li>
</ol>2. 하위 배양 세포
<ol><li>세포가 약 80% 합류에 도달하면, 세포 배양 플라스크(표면적 25 cm2)로부터 소비배지를 제거한다.</li>
	<li>칼슘과 마그네슘이...

<ol>
	<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons:+the+P19+pathway.">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway.">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li><li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression.">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li><li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns.">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li><li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells.">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li><li>Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells.">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li><li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine,+nitrite,+and+nitrate+developmental+toxicity.">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li><li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation.">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li><li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells.">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li><li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19,+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity.">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).</li><li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells.">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li><li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment.">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li><li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation.">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li><li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells.">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li><li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activation+of+retinoic+acid+(RA)-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+(RAR+alpha)-,+RAR+beta-,+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand.">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li><li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid.">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li><li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons.">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters.">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li><li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro.">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells.">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li><li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells.">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin.">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li><li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum.">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li><li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+(embryonal+carcinoma)+cell+line.">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li></ol>

여기서, 우리는 P19 세포주를 사용하여 신경 발생에 대한 간단한 프로토콜을 기술한다. 많은 보고가 이 점에서 간행되었더라도, P19 세포주를 사용하여 신경 발생 유도를 위한 상세한 방법론은 불분명합니다. 또한, 우리는 전체 실험에 대해 10 % FBS를 가진 간단한 높은 포도당 (4,500 mg / L) DMEM 배지를 이용했습니다. 이를 통해 우리는 사용자 친화적 인 방식으로 신경 성 실험을 수행하고 미래를 위해이 ...

배아 발달 도중, 단 하나 세포 층은 3개의 개별적인 세균 층 1,2,3로변환됩니다. 생체 내에서 발생하는 현상의 연구 가능성을 높이기 위해 3차원 응집체(배아 체)의 생성이 편리한 모델로 개발되었습니다. 이러한 방식으로 형성된 세포 응집체는 배아4,5의발달을 반영하는 세포 분화를 유발하는 다양한 조건에 노출될 수 있다. P19 뮤린 배아 암종 세포주(P19 세포주)는 일반적으로 시험관내 신경발생 연구를 위한 세포모델로서 사용된다 6,7,8. P19 세포주 전형적인 다능성 줄기 세포 특징을 전시하고 부착 조건하에서 신경 쇠산 다음에 세포 응집 도중 레티노산 (RA)의 존재에 있는 신경으로 분화할 수 있습니다. 더욱이, 미분화 P19 세포주또한 디메틸 설폭사이드(DMSO)9,10,11,12의영향을 받아 근육-및 심근세포 유사 세포를 형성할 수 있다.
많은 방법13,14,15,16은 신경 분화에 대해 보고되었지만, 방법론은 때때로 복잡하고 설명만 읽음으로써 파악하기가 쉽지 않다. 예를 들어, 프로토콜은 때때로 종아리 혈청(CS) 및 태아 소 혈청(FBS)13의혼합물로 보충된 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) 배지의 조합을 필요로한다. 더욱이, 신경 발달에 사용되는 매체는 종종 신경분과 B27 보충제13,14,15,16으로구성된다. 따라서 기존 메서드에는 준비의 복잡성이 포함되어 있으며 여기서의 목표는 프로토콜을 단순화하는 것입니다. 본 연구에서, 우리는 FBS를 가진 DMEM이 P19 세포주 (DMEM + 10% FBS)뿐만 아니라 신경 발달 (DMEM + 5% FBS + RA)을 유지하는 데 이용될 수 있음을 입증하였다. P19 세포주를 사용하여 신경 발생을 위한 이 단순화한 방법은 우리가 신경세포가 어떻게 개발되는지의 분자 기계장치를 공부하는 것을 허용합니다. 더욱이, 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에 대한 연구도 P19 세포주17,18을이용하여 진행되고 있으며, 본 연구에서 개발된 방법이 이를 해명하는 데 한 몫을 할 것으로 믿습니다. 신경 발달 이상 및 신경 퇴행성 질환의 분자 메커니즘.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:819px;" width="818">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0260-01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">cDNA synthesis kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0801-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:347px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">10236276001</td>
			<td style="width:215px;">Working concentration: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:347px;">DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE12-604Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol 99.8%</td>
			<td style="width:103px;">Chempur</td>
			<td style="width:155px;">CHEM*613964202</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E5050-03</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">MAP2 antibody</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">PA517646</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PCR reaction kit</td>
			<td style="width:103px;">EURx</td>
			<td style="width:155px;">E0411-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+</td>
			<td style="width:103px;">Lonza</td>
			<td style="width:155px;">BE17- 517Q</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:215px;">&#160;dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 &#176;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:347px;">Secondary Antibody (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A11034</td>
			<td style="width:215px;">Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Skim milk</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">1153630500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:347px;">Trypsin 0.25% - EDTA in HBSS, without&#160; Ca2+, Mg2+,with Phenol Red</td>
			<td style="width:103px;">biosera</td>
			<td style="width:155px;">LM-T1720/500</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">Cell Culture Plastics</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.01</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">10 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm dish dedicated for suspension culture</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">C351029</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430791-500EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">5 mL Serological Pipettes</td>
			<td style="width:103px;">Profilab</td>
			<td style="width:155px;">515.05</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:103px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:347px;">Cell culture flasks, surface area 25 cm2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma- Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">CLS430639-200EA</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurogenesis using p19 embryonal carcinoma cells

마우스 배아 유래 기형암유래 P19 세포주들은 3개의 세균 층으로 분화하는 능력을 가지고 있다. 레티노산(RA)의 존재에서, 현탁액 배양된 P19 세포주들은 뉴런으로 분화하도록 유도된다. 이 현상은 시험관에서 신경 발생 모델로 광범위하게 조사된다. 따라서, P19 세포주신경발생과 관련된 분자 및 세포 연구에 매우 유용하다. 그러나, 문헌에 기재된 P19 세포주신경 분화를 위한 프로토콜은 매우 복잡하다. 이 연구에서 개발 된 방법은 간단 하 고 신경 발달 이상 및 신경 퇴행 성 질환에 분자 메커니즘을 해명에 역할을 할 것 이다.

P19 세포주에서 신경 발생 유도에 대한 프로토콜의 단순화 된 계획은 도1에 제시되어 있다. P19 세포주의 특성을 미분화 상태 및 신경 발생 시 정의하기 위해 RT-PCR(역전사-폴리머라제 연쇄 반응) 방법을 사용하였다. 미분화 P19 세포주들은 유기 양이온/카르니틴 트랜스포터4(Oct4) 및 나노홈박스(Nanog)와 같은 다능성 유전자를 발현하였다. RA?...

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Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

P19 마우스 배아 암세포주(P19 세포주)는 생체내 분석에 비해 매우 단순화된 신경발생의 분자 기전을 연구하는데 널리 사용된다. 여기서, 우리는 P19 세포주에서 레티노산 유도 신경발생에 대한 프로토콜을 제시한다.

P19 배아 암종을 이용한 신경 발생

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

P19 세포주 신경으로 분화 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, P19 세포주 뉴런 분화를 위한 프로토콜은 때때로 복잡합니다. 이 방법을 통해 우리는 사용자 친화적 인 방식으로 신경 유발 실험을 수행하고 미래를위한 P19 세포주 사용 가능성을 확대 할 수 있습니다.시작하려면, DMEM로 구성된 유지 보수 매체에서 P19 세포를 유지, 와 4.5 포도당의 리터 당 그램, 보충 10% 태아 소 혈청, 100 밀리 리터 페니실린 당 단위, 그리고 100 밀리리터 연쇄 상 감식 당 단위. 세포 배양을 섭씨 37도 및 5%의 이산화탄소 환경에서 세포가 약 80%의 컨실업할 때까지 배양합니다. 세포 배양에서 소비된 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 2밀리리터로 세포를 세척합니다.세포의 단층을 완전히 커버하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 2~3분 동안 배양하기 위해 0.25%의 트립신-EDTA 1밀리리터를 추가합니다. 현미경의 밑에, 모든 세포가 분리되어 있는지 확인하십시오. 트립신을 중화시키기 위해 유지 보수 매체의 9 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.세포를 15밀리리터 튜브와 원심분리기로 200배 G및 실온으로 5분간 전달하여 세포를 펠릿합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 상류체를 흡인시합니다. 신선한 유지 보수 매체의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 제조업체의 지침에 따라 세포 수를 결정하기 위해 셀 카운터를 사용합니다.씨앗 20, 새로운 T-25 플라스크에 평방 센티미터 당 000 세포및 유지 보수 매체의 최대 10 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2~3일 동안 배양합니다. 트립신 소화를 시작하려면 먼저 체퍼를 천천히 흡인시키고 칼슘과 마그네슘이없는 PBS의 두 밀리리터로 세포를 씻으십시오.그런 다음, 세포에 0.25%의 트립신 EDTA의 1 밀리리터를 추가하고 2 ~ 3 분 동안 섭씨 37도 및 5 %의 이산화탄소로 배양합니다. 인큐베이션 후, 트립신을 중화시키고, 포도당 수준이 높은 DMEM로 구성되고 5%의 태아 소 혈청, 밀리리터 페니실린 당 100단위, 밀리리터 연쇄절제술당 100단위로 보충된 분화 매체의 9밀리리터에서 세포를 재연한다. 세포를 15밀리리터 튜브와 원심분리기로 200배 G및 실온으로 5분간 전달하여 세포를 펠릿합니다.그런 다음, 서서히 상류체를 흡인하고 RA없이 신선한 분화 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 재중단합니다. 셀 카운터를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 셀 번호를 결정합니다. 집계 생성의 경우, 100 밀리리터, 비처리 배양 접시에 5개의 마이크로리터로 보완된 분화 매체10밀리리터를 첨가하여 시작합니다. 배양 접시에 100만 개의 세포를 심고 2일 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양하여 골형성을 촉진합니다.인큐베이션 후, 10밀리리터 파이펫을 사용하여, 골재를 포함하는 매체를 흡인하고 실온에서 15 밀리리터 튜브로 옮김시한다. 골재가 바닥에 정착할 때까지 1.5분 동안 기다린 다음 상체를 폐기하십시오. 0.5 마이크로몰라 RA로 보충된 신선한 분화 매체 10밀리리터를 추가합니다. 새로운 100mm, 비처리 배양 접시에 골재를 부드럽게 시드하고 2일 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.시작하려면 10밀리리터 파이펫을 사용하여 셀 응집체를 15밀리리터 튜브로 전송합니다. 골재가 바닥에 정착한 다음 상체를 폐기할 때까지 실온에서 1.5분 동안 기다립니다. 혈청과 항생제가 없는 DMEM으로 골재를 씻으시다.셀 골재가 바닥에 정착하고, 상체를 폐기하고, 0.25%의 트립신 EDTA의 2밀리리터를 추가할 때까지 기다립니다. 10 분 동안 37섭씨 37도의 수조에서 튜브를 배양하여 2분마다 눌러 세포를 서스펜션 상태로 유지합니다. 그런 다음 트립신 활성을 중지하기 위해 유지 보수 매체의 4 밀리리터를 추가하고 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 20 회 위아래로 피펫을 피펫합니다.마지막으로, 세포를 200배 G로, 실온을 5분 동안 원심분리합니다. 상체를 제거하고 유지 보수 매체의 5 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 분리합니다. 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 결정하고 세포도금으로 진행합니다.플레이트 셀에 먼저 유지 보수 매체의 웰당 3 밀리리터를 6웰 배양 판에 넣습니다. 그런 다음, 세포를 500, 000의 밀도로 잘 시드한다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.6웰 배양판에 커버 안경에 세포를 시드. 20%의 합류에 도달하면, 항 MAP2 항체로 면역염색을 진행한다. 이어서, RNA를 분리하고, MAP2, 누엔, OCT4, NANOG 및 GAPDH에 대한 역전사 PCR을 수행한다.이 연구에서는, 신경 분화를 위한 단순화된 방법이 소개됩니다. P19 세포주5%FBS 와 0.5 마이크로몰라 RA를 가진 비처리 배양 접시에서 배양된다. 4 일 후, 세포 응집체는 트립신과 해리되고 다음 4 일 동안 부착 된 세포 배양 판에 시드됩니다. 이 방법의 효율은 미분화 상태 및 신경 발생 시 P19 세포주의 RTPCR 분석 사이의 비교에 의해 평가된다.결과는 10월4및 NANOG와 같은 흉병 유전자의 발현의 급속한 감소및 MAP2 와 NeuN과 같은 neurnomal 마커 유전자의 강화 조절을 보여줍니다. 우리는 이 연구 결과에서 개발된 방법이 간단하고 신경 발생의 분자 기계장치를 해명하는 역할을 할 것이라는 점을 믿습니다, 신경 퇴행성 질병.