Bu eser kısmen JSP'ler gelen araştırma hibe tarafından desteklenmiştir (KAKENHI 18K 07389), Japonya, Takeda Bilim Vakfı, Japonya ve Kobayashi ilaç Co., Ltd., Japonya.

Tüm deneyler kılavuzlarınıza uygun olarak bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Toyama Üniversitesi Sugitani kampüsünde yapılmıştır ve hayvan bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Sugitani kampüsünde Komitesi tarafından kabul edildi Üniversitesi, Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. Daralt tahlil
<ol><li>Poli-D-lizin kaplama<ol>
<li>8-şey kültür slaytlar ile 5 μg/mL poli-D-lizin (PDL) 400 μL fosfat tamponlu tuz (PBS) kat ve onları gece 37 ° C'de kuluçkaya.</...

Bu çalışmada açıklanan protokol aksonal büyüme koniler erken olayları gözlem Aβ1-42 tedaviden sonra etkin. Aβ1-42 endositoz aksonal büyüme koni içinde 20 dk içinde indüklenen ve büyüme koni Daralt tedavinin içinde 1 h gözlendi. Bu endositoz muhtemelen clathrin tarafından aracılık. Bu iletişim kuralını kullanarak, clathrin-aracılı endositoz inhibisyonu Aβ1 42 bağlı büyüme koni çöküşü ve kültürlü nöronlar27aksonal dejenerasyon önlemek için doğrulandı. Ay...

Amiloid-β (Aβ) mevduat Alzheimer hastalığı (Ah) hastalarda beyin bulunur ve nöronal ağlar, bozabilir reklam1 bellek bozuklukları2,3,4' e giden kritik bir nedeni olarak kabul edilir. Birçok klinik ilaç adaylarının etkili amiloid-β (Aβ) üretim önlemek veya Aβ mevduat kaldırma gösterilmiştir. Ancak, hiçbiri reklam hastalar5işlevinde bellek iyileştirmede başarılı olması. Aβ bellek bozuklukları6başlangıcından önce beyinde yatırılır; Bu nedenle, hastaların beyinlerinin seviyelerinde Aβ azalan sergileri bellek bozuklukları etkisiz olabilir. Aβ ifade preklinik reklam hastalarda mevcuttur; Ancak, bu hastaların nadiren nöronal dejenerasyon ve bellek açıkları6ile mevcut. Aβ ifade ve bellek bozuklukları arasında bir zaman farkı vardır. Bu nedenle, reklam önlenmesi için kritik bir strateji Aβ toksisite reklam, önce bellek açıkları gelişimi erken aşamalarında sinyali engelliyor. Aβ ifade için bir bozulma yol açabilir axon dejenerasyon7,8,9,10,11,12,13, neden olmaktadır. sinir ağları ve bellek işlevinin sürekli bozulma. Birçok çalışma mekanizmaları Aβ toksisite araştırdık; Örneğin, dejenere aksonlar, reklam farelerin beyinlerinin autophagy14artış gösterilmiştir. Kalsinörin harekete geçirmek aksonal dejenerasyon Aβ kaynaklı15olası bir mekanizma olarak bildirilmiştir; Ancak, aksonal dejenerasyon doğrudan tetikleyici bilinmeyen kalır.
Bu çalışmada aksonal sonlar büyüme koniler olarak adlandırılan çöküşü odaklanır. Aksonal büyüme koniler çöküşü aksonal büyüme kovucular, semaphorin-3A ve ephrin-A516,17,18,19,gibi20neden olabilir. Çöküşü gibi distrofik aksonal sonlar hastalar21,22yılında beyinlerinde gözlenmiştir. Ayrıca, büyüme koni işleyen bir başarısızlık aksonal dejenerasyon23sebep olabilir. Ancak, ister Aβ büyüme koni Daralt indükler bilinmemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada Aβ erken etkileri kültürlü nöronlar içinde gözlemlemek ve Aβ kaynaklı büyüme koni Daralt araştırmak için yeni bir protokol sunar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1119">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">ddY mice</td>
			<td style="width:133px;">SLC</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:539px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eight-well culture slide</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poly D lysine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-19041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Culture medium, Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">house serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>074-00522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Filter with 70 &#181;m mesh size, cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CO2 incubator</td>
			<td>Astec</td>
			<td>SCA-165DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Amyloid &#946;1-42</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted microscope A</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z1&#160;</td>
			<td>Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Plan-Apochromat 20x</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420650-9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Plan-Apochromat 63x</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>440762-9904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2 IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-tau-1 IgG</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB3420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-amyloid &#946; antibody</td>
			<td>IBL</td>
			<td>10379</td>
			<td>clone 11A1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal goat serum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bovine serum albumin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>010-25783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">t-octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-21105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">hot plate</td>
			<td>NISSIN</td>
			<td>NHP-M30N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>1000-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone RTV</td>
			<td>Shin-Etsu</td>
			<td>KE42T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">hand punch</td>
			<td style="width:133px;">Roper Whitney</td>
			<td style="width:109px;">No. XX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescence membrane probe, FM1-43FX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ca2+- and Mg2+-free Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Transfection solution, Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator, Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted microscope B</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">Image software, ImageJ</td>
			<td style="width:133px;">NIH</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:539px;">https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing axonal growth cone collapse and early amyloid &#946; effects in cultured mouse neurons

Amiloid-β (Aβ) bellek bozuklukları Alzheimer hastalığı içinde (Ah) neden olur. Tedavi gösterilen rağmen reklam hastaların beynindeki Aβ düzeyleri azaltmak için bunlar hafıza fonksiyonları geliştirmek değil. Bellek bozuklukları görünümünü önce beyinde Aβ toplar beri Aβ hedefleme zaten bellek açıkları sergileyen reklam hastaları tedavi etmek için verimsiz olabilir. Bu nedenle, aşağı akım Aβ birikimi nedeniyle sinyal reklam geliştirme önce engellenmelidir. Aβ aksonal dejenerasyon, nöronal ağlar ve bellek bozuklukları kesintiye uğraması için önde gelen neden olmaktadır. Aβ toksisite mekanizmalar üzerinde birçok çalışma olmasına rağmen kaynak Aβ toksisitesi bilinmemektedir. Kaynağını belirlemeye yardımcı olması için mikroskopi, gen transfection ve canlı hücre tarafından Aβ kültürlü nöronların aksonal büyüme koni içinde neden erken değişiklikleri öğrenmek için Imaging kullanan yeni bir iletişim kuralı öneriyoruz. Bu iletişim kuralı Aβ endositoz inhibisyonu Aβ toksisite engel olduğunu gösteren clathrin aracılı endositoz büyüme koni çöküntü, takip aksonal büyüme koni içinde indüklenen saptandı. Bu iletişim kuralı Aβ erken etkileri okumak yararlı olacaktır ve daha verimli ve önleyici reklam tedavi neden olabilir.

Kuluçka Aβ1-42 toksik formları27,28,30,35üretmek için ihtiyaç vardı çünkü bu protokol için kullanmadan, 7 gün için 37 ° C'de Aβ1-42 inkübe. Bu kuluçka sonra Aβ toplanan formları (Şekil 1A) tespit edildi. Bu Aβ1-42 benzer kuluçka Aβ36fibriller şeklinde üretilen bildirilmiştir. Bu topl...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons at JoVE.com

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Burada amiloid-β (Aβ) beyindeki erken etkilerini araştırmak için bir protokol sunulmuştur. Bu Aβ clathrin aracılı endositoz ve aksonal büyüme koniler çöküşü indükler gösterir. İletişim kuralı erken etkileri Aβ aksonal büyüme koniler okumak yararlı ve Alzheimer hastalığı önleme kolaylaştırabilir.

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Bu yöntem Alzheimer hastalığı araştırma alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, özellikle erken olaylar büyüme koni çöküşü dahil. Bu tekniğin en büyük avantajı, amiloid beta tedavisinden hemen sonra aksonal büyüme konileri görselleştirmek ve analiz etmektir. Antibiyotik olmadan nöron kültür ortamda embriyonik gün-14 farelerden taze izole serebral kortekskıyma mikro-makas kullanarak başlayın.Dokuları toplayın ve 87G'de üç dakika boyunca dokuları santrifüj edin. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın ve pelet için% 0.05 trypsin iki mililitre ekleyin. 37 santigrat derece 15 dakika kuluçka ve her beş dakikada bir dokunarak karıştırın.15 dakika sonra, tripsin nötralize etmek için orta A dört mililitre ekleyin ve dokunarak karıştırın. Sonra dokuları 178 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Supernatant çıkardıktan sonra, DNaase ve soya tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin ve daha önce olduğu gibi her beş dakikada bir karıştırma ile 37 santigrat derece 15 dakika kuluçka.Kuluçka süresi dolduğunda, daha önce olduğu gibi orta A.Mix ve santrifüj dört mililitre ekleyin. Supernatant çıkardıktan sonra, orta A dört mililitre ekleyin ve hiçbir enkaz gözlenene kadar cilalı Pasteur pipet ile dokuları triturate. Ardından, 70 mikron gözenek boyutunda örgü ile tritulenmiş dokuları filtreleyin.Filtrasyondan sonra, hücreleri hemositometre ile sayın ve hücre yoğunluğunu hesaplayın. Pipet 0.8 kez 10 orta A dördüncü hücrelere sekiz kuyukültür slayt her kuyuiçine. Daha sonra 37 santigrat derecede %10 CO2 nemli bir atmosferde kuluçkaya yatırın.Dört saatlik kültürden sonra, kültür ortamını orta b.Bu yöntemi kullanan nöronların saflığı yaklaşık %75'tir Ticari olarak elde edilen tam uzunlukta a beta 42'nin taze bir şişesini açarak ve içindekileri steril, damıtılmış sudaki içeriğini 0,5 milimolar konsantrasyonuna eriterek bu testi en az bir hafta önceden başlatın. Toplama ve toksisite yi tetiklemek için 7 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Toplu A beta 1-42 aliquots hazırlayın ve kullanıma kadar eksi 80 santigrat derece saklayın.Nöronal kültürün dördüncü gününde, daha önce gösterildiği gibi bir saat boyunca orta B'de 0,5 mikromolar toplanmış 100 mikrolitre ile kuyuları tedavi edin. Saat geçtikten sonra, kültür ortamını çıkarın ve hemen bir sıcak plaka üzerinde 37 santigrat derece bir saat pbs% 4 sakaroz içeren% 4 paraformaldehit ile nöronlar düzeltmek. Büyüme konilerinin şeklini korumak bu protokol için çok önemli olduğundan fiksasyon en önemlidir.Fiksasyondan sonra, nöronları PBS ile üç kez yıkayın. Sonra oda çıkardıktan sonra, sulu bir montaj ortamı ile nöronlar monte. Montaj ortamını dört derecede 2-4 gün kurulayın.Ters bir mikroskop üzerinde 20X kuru objektif ile her kuyunun tüm alanını yakalayın. Her kuyudaki tüm alanı yakalamak ve analiz etmek öznellikten kaçınmak için önemlidir. Üçüncü veya dördüncü evredeki her nöronun en uzun nöritlerini akson olarak sınıflandırın.Lamellipodia eksik veya üç filopodia daha az sahip aksonal büyüme konileri çökmüş büyüme konileri olarak kabul edilir. Kuluçkadan önce burada gösterilen beta 1-42 oligomerleri, 7 günlük kuluçkadan sonra 37 santigrat derecede toplanır. A beta 1-42 ile birleştirilmiş tedaviden sonra, A beta toksik oligomer için bir antikor ile immünboyama A beta 1-42 tedavi nöronlar kırmızı pozitif boyama gösterir, ancak araç tedavi nöronlar.Beta 1-42 tedavisi ile indüklenen erken olgular kültürde dört gün sonra analiz edildi. Tanımlanan aksonlar, yeşil renkte gösterilen MAP-2'de kırmızı ve negatif immünoboyama ile gösterilen aksonal belirteç tau-1 için pozitif immünboyama ile doğrulandı. Araç tedavisi bir saat sonra, büyüme konileri lamellipodia ve birkaç filopodia yayıldı.Bunlar sağlıklı büyüme konileri olarak tanımlanmış. Tersine, Bir beta 1-42 tedavi bir saat hiçbir lamellipodia veya filopodia geliştirilen küçülmüş büyüme konileri yol açtı. Bunlar çökmüş büyüme konileri olarak tanımlandı.Bu yordamı çalışırken, benim-nor-idge bu fiksasyon protokolü en iyi 37 santigrat derece% 4 PFA ve% 4 sakaroz ile hücreleri düzeltmek için hatırlamak önemlidir. Bu protokolü takiben, akson büyüme konilerinin ne zaman ve nasıl çöktüğü ve çöken büyüme kozalalarının nasıl kurtarıldığı gibi ek soruları yanıtlamak için canlı hücre görüntüleme ve gen transfeksiyonu gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.