Producerar genen borttagningar i Escherichia coli av P1 transduktion med punktskattepliktiga antibiotikaresistens kassetter

En första metod att studera funktionen av en okänd gen hos bakterier är att skapa en knock-out av denna gen. Här beskriver vi en robust och snabb protokoll för att överföra genmutationer borttagning från en Escherichia coli stam till en annan med hjälp av generaliserad transduktion med bacteriophage P1. Denna metod kräver att mutationen kan väljas (t.ex. baserat på genen störningar med antibiotika kassett infogningar). Sådana antibiotika kassetter kan mobiliseras från en donator stam och införas till en mottagare stam av intresse för snabbt och generera enkelt en gen radering mutant. Antibiotikum kassetten kan utformas att inkludera flippase erkännande webbplatser som tillåter excision av kassetten genom en platsspecifik recombinase att producera en ren knock-out med endast en ~ 100-base-par-långa ärr sekvens i genomet. Vi visar protokollet genom att slå ut den tamA -gen som kodar en församling faktor inblandad i autotransporter biogenes och testa effekten av denna knock-out på biogenes och funktion av två trimeric autotransporter adhesiner. Även gen radering av P1 transduktion har sina begränsningar, gör den lätthet och snabbhet av dess genomförande det ett attraktivt alternativ till andra metoder för genterapi radering.