Vi takke Dr. F. Port, Dr. K. O'Connor-Giles og Dr. S. Feng for drøftelser om CRISPR strategi; Dr. T.B. Kornberg og Bloomington Stock Center for reagenser; UMD imaging core facilitet; og midler fra NIH: R00HL114867 og R35GM124878 til SR.

1. designe og konstruere gRNA udtryk vektor
<ol><li>For at netop erstatter en lang definerede region af en exon, bruge en dobbelt gRNA tilgang6, hvor hver gRNA kan målrettet mod to ender af det valgte område af interesse. For at opnå nøjagtige gen-specifikke spatiotemporelle udtryk for driveren, skal du vælge to gRNA målwebsteder inden for den første kodning exon af genet.</li>
	<li>
Drosophila melanogaster, Vælg gRNA målrette websteder ved hjælp af værktøjet flyCRIS...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Lai, S. -. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+targeted+expression+system+for+branchless+and+characterization+of+novel+cellular+expression+patterns+of+the+gene+in+Drosophila.">Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila.</a> Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).</li><li>Doench, J. G., Hartenian, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs.">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li><li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases.">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3. 3 (4), 657-664 (2013).</li><li>Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li><li>Lin, C. -. C., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+Transgenic+DNA+Components+by+Inducible+Gene+Replacement+in+Drosophila+melanogaster.">Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).</li><li>Li, W., K&#246;ster, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control,+modeling,+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR.">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).</li></ol>

Traditionelt, blev Drosophila enhancer fælder genereret af to forskellige metoder. En af måder omfatter tilfældige indsættelse af en driver (fx., Gal4) sekvens i genomet af gennemførelse (fx., P-element gennemførelse)1 . Alternativt, driver sekvenser kan placeres under transcriptional kontrol af en formodede forstærker/promotor-regionen i en plasmid konstruktion, som ville derefter integreres i en ektopisk site af genom3,<sup cla...

Den genetiske værktøjskasse til målrettede genekspression har været veludviklet i Drosophila, hvilket gør det en af de bedste model til at undersøge funktionen af gener involveret i en bred vifte af cellulære processer. Binært udtryk systemer, såsom gær Gal4/UAS (opstrøms aktivering sekvens), blev først vedtaget for væv-specifikke enhancer diffusering og gene misexpression i Drosophila genetiske model1 (figur 1). Dette system fremmet udviklingen af en lang række teknikker som spatiotemporelle regulering af genet overekspression, misexpression, knockout i udvalgte grupper af celler samt som celle ablation, celle mærkning, live sporing af cellulære og molekylære processer i embryo og væv, afstamning sporingen og mosaik analyser under udvikling. En række binære transskription system, såsom den bakterielle LexA/LexAop system (figur 1) og Neurospora Q-system, er stærke genetiske værktøjer, der er nu udbredt i Drosophila, ud over den oprindelige Gal4/UAS system for målrettede gen expression1,2,3.
Vi præsenterer her, en metode til at generere meget pålidelige væv-specifikke binære udtryk systemet ved at ansætte en genom-redigering teknik. De seneste fremskridt i CRISPR/Cas9 genom redigering teknologi har tilladt hidtil usete muligheder for at gøre styret genom ændringer i en bred vifte af organismer. I forhold til de andre tilgængelige genom redigering teknikker, er CRISPR/Cas9-systemet billig, effektiv og pålidelig. Denne teknologi anvender komponenter af den bakterielle adaptive immunsystem: en Cas9 liv1975 af Streptococcus pyogenes , der skaber en dobbelt-strenget pause (DSB) og en kimære guide-RNA (gRNA), som guider Cas9 for et websted til et bestemt genom målrettet DSB4. Cellerne indeholder maskineri for at reparere DSB ved hjælp af forskellige veje. Ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) fører til små indrykninger eller sletninger at forstyrre genfunktion, mens homologi-instrueret reparation (HDR) indfører en defineret instrueret/ønskeligt genomisk knock-i/knock-out ved hjælp af en udefrakommende HDR donor som en skabelon. Den HDR-baserede udskiftning strategi udnyttes effektivt for at generere en yderst pålidelig væv-specifikke binære udtryk system, som kan overvinde begrænsningerne af traditionel forstærker fælde metoder. Vi beskriver en trinvis fremgangsmåde for udnyttelse af CRISPR/Cas9-baserede HDR reparation til at generere en binær transskription driver linje, der kommer til udtryk under kontrol af endogene transcriptional og post-transcriptional regulering af en Drosophila gen. I denne protokol, vi vise generation af en specifik for driveren forgreningsløse (bnl) gen kodning en FGF familie protein, der regulerer forgrening morfogenese af luftrør luftvejene epitel5. I dette eksempel, den første kodning exon af bnl genet blev erstattet af rækkefølgen af en bakteriel LexA transaktivatoren sekvens uden at ændre nogen endogene cis-regulerende sekvenser af bnl genet. Vi viser, at strategien genereret en bnl-LexA driver linje, der spatiotemporally styrer udtryk af en reporter gen placeret neden for LexAoperator (LexAop eller LexO) udelukkende i bnl- at udtrykke epitelial/mesenchymale/neuronale celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>X-Gal/IPTG</td>
			<td>Gentrox (Genesee Scientific)</td>
			<td>18-218</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD&#160;244520</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1161</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10977-023</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10%SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>P1190</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210006</td>
			<td>Maxiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCFD4</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>DNA template and vector for gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td>
			<td>Kapa biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5-high fidelity Taq</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #M0491</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #E2611</td>
			<td>DNA assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBPnlsLexA:p65Uw</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DNA template for LexA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR PreMix, with dye (red)</td>
			<td>Sydlab</td>
			<td>MB067-EQ2R</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel elution kit</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-300</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA purification kits</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-330</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E5315S</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lexO-CherryCAAX</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-CD8:GFP</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>btl-Gal4</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MKRS/TB6B</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope SP5X</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Imaging expression pattern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 station</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-122WCU</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ-61</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube homogenizing pestles</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>03-421-217</td>
			<td>genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing

Binære transskription systemer er stærke genetiske værktøjer bruges til visualisering og manipulere celle skæbne og gen udtryk i bestemte grupper af celler eller væv i modelorganismer. Disse systemer indeholder to komponenter som separate transgene linjer. En driver linje udtrykker en transcriptional aktivator under kontrol af væv-specifikke initiativtagerne/smagsforstærkere, og en reporter-effektor linje havne et target gen placeret nedstrøms til bindingssted af transkription aktivere. Dyr husly begge komponenter fremkalde væv-specifikke transactivation for en target genekspression. Præcise spatiotemporelle udtryk af genet i målrettet væv er kritisk for objektiv fortolkning af celle-genet aktivitet. Derfor er udvikle en metode til at generere eksklusive celler/væv-specifik driver linjer afgørende. Her præsenterer vi en metode til at generere meget væv-specifikke målrettede udtryk systemet ved at ansætte en "grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske Repeat/CRISPR-forbundet" (CRISPR/Cas)-baseret genom-redigering teknik. I denne metode guide liv1975 Cas9 er målrettet to kimære RNA'er (gRNA) til bestemte websteder i den første kodning exon af et gen i Drosophila genom oprette dobbelt-strenget pauser (DSB). Efterfølgende, kan ved hjælp af en udefrakommende donor plasmid som indeholder transaktivatoren sekvens, celle-selvstændig reparation maskiner homologi-instrueret reparation (HDR) af DSB, hvilket resulterer i præcise fjernelse og udskiftning af exon med transaktivatoren sekvens. Bankede i transaktivatoren er udtrykt udelukkende i celler hvor cis-regulerende elementer af udskiftede genet er funktionelle. Detaljerede trinvise protokollen præsenteres her til at generere en binær transcriptional driver udtrykt i Drosophila fgf/forgreningsløse-producerer epitelial/neuronale celler kan vedtages for enhver gen - eller væv-specifikke udtryk.

Denne protokol blev med held bruges til at generere en målrettet binære udtryk reporter system specifik for bnl udtrykker celler5. Cis-regulerende elementer (CREs) at styre komplekse spatiotemporelle bnl udtryk er ikke karakteriseret. Derfor, for at opnå spatiotemporelle udtryk under kontrol af den endogene bnl regulerende sekvens, kun den første kodning exon af bnl var designet til at blive erstattet med sekvensen a...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing at JoVE.com

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Vi præsenterer her, en metode til at generere væv-specifikke binære transskription systemer i Drosophila ved at erstatte den første kodning exon af gener med transskription drivere. CRISPR/Cas9-baseret metode placerer en transaktivatoren sekvens under den endogene regulering af et afløste gen, og derfor letter transctivator udtryk udelukkende i gen-specifikke spatiotemporelle mønstre.

En effektiv strategi til at generere væv-specifikke binære transskription systemer i Drosophila af genom-redigering

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Det overordnede mål med denne metode er at generere et meget vævsspecifikt målrettet ekspressionssystem. I denne metode demonstrerede vi generationen af en binær transskriptionel driver, der er specifik for vores Drosophila FGF homolog, branchless. Dynamisk, spatiotemporal udtryk for branchless regulerer filial hæmostik af luftrørets luftrør epitel.Selv om denne metode kan give indsigt i det spatiotemporale udtryk og migration af branchless producerende celler, kan det nemt anvendes på andre gener og væv i Drosophila eller i andre modelorganismer, såsom C.Elegans og zebrafisk. Den største fordel ved denne teknik er, at den genererer ekspressionssystemer, der er meget pålidelige, vævs- og genspecifikke og udelukkende aktive i celler, hvor cis-reguleringselementerne i det erstattede gen er funktionelle. Binære transskriptionssystemer er vigtige værktøjer til målrettet genekspression og manipulation.En transaktivator, såsom GAL4 eller LexA, udtrykt under kontrol af cis regulerende elementer af et gen, drive en effektor trans gen, der er placeret nedstrøms for specifikke transskriptionsbinding steder, ligesom UAS for GAL4 og / eller LexO for LexA. Denne metode erstatter den første kodning exon af branchless genet med transskription driver. CRISPR Cas9-baserede metode placerer en LexA transaktivatorsekvens under den endogene regulering af det branchless-gen og letter derfor transaktivorudtryk udelukkende i branchless specifikke spatiotemporale mønstre.Begynd med at vælge to guide RNA-målwebsteder, der specifikt er målrettet mod to ender af den valgte interesseregion. Åbn det valg af CRISPR-designværktøj. Fly CRISPR Optimal Target Finder bruges her.Klik på Vælg Genom'insert rækkefølgen af interesse, og vælg den seneste uploadede Drosophila melanogaster genom anmærkning, i øjeblikket R understreger seks, i rullemenuen. Klik derefter på Vælg hjælpelinjelængde'og input 20. Vælg Alle CRISPR-mål', og klik på Find CRISPR-mål.Evaluer alle kandidatguide RNA-mål ved at sætte maksimum for stringens og kun NGG'for PAM. For at generere en tandem guide RNA udtryk vektor, første PCR forstærke et DNA-fragment til at indføre to proto spacer sekvenser i en pCFD4 RNA udtryk vektor rygrad. Brug en fremad- og bakprimer, hver med en proto-afstandssekvens, og overlap med pCFD4-vektorsekvensen i en PCR ved hjælp af high-fidelity polymerase og pCFD4-skabelon-DNA.For at forberede pCFD4 til kloning skal plasmid fordøjes med Bbs1-enzym. Der skal oprettes en reaktion i den passende fordøjelsesbuffer, der indeholder to til fem mikrogram pCFD4 plasmid og en mikroliter bbs1-enzym og et endeligt volumen på 50 mikroliter. Bland reaktionsindholdet ved at trykke på røret og samle alle de spredte dråber fra rørets væg til bunden med et kort spin.Inkuber reaktionsblandingen ved 37 grader Celsius i to timer efter at have kørt PCR-produktet og fordøjet plasmid på en en procent agarosegel. Rens det 6,4 kilobase par lineære plasmid og 600 base par PCR produkt ved hjælp af standard gel rensning kolonner. Konfigurer DNA-monteringsreaktionen i henhold til producentens protokol.For genomisk knock-in af en GAL4- eller LexA-sekvens skal du designe en dobbeltstrenget HDR-donor, der indeholder transaktivorsekvensen, flankeret af to homologiarme. For at undgå at re-målretning af guide RNA til manipuleret locus, designe udskiftning donor på en sådan måde, at vejledningen RNA anerkendelse steder forstyrres af den udefrakommende sekvens indført. Også, for at undgå at ændre renheden af cis regulerende elementer, altid vælge guide RNA anerkendelse steder inden for kodning exon region.Hvis du vil generere en erstatningskassette, skal du planlægge DNA-samlingsstrategien for at slutte fire segmenter sammen. De fem prime og tre prime homologi arme, den midterste udefrakommende trans aktivator DNA-sekvens, og den lineariserede kloning vektor rygrad. PCR forstærker en GAL4- eller LexA-udtrykskassette fra en passende vektor, og PCR forstærker homologiarmene fra det genomiske DNA, der er udvundet fra den overordnede fluelinje, der er udvalgt til injektion.Brug high-fidelity polymerase i hver PCR til at generere målet fragmenter. For at opsætte DNA-samlingsreaktionen blandes den lineære kloningsvektor og målfragmenter, der genereres af PCR-kloning, med DNA-samlingsmastermixen og et endeligt reaktionsvolumen på 20 mikroliter i henhold til producentens anvisninger. Inkuber reaktionsblandingen i en time ved 50 grader Celsius.Når Nos-Cas9-embryoner tidligere injiceres med både guide RNA-udtrykket plasmid og erstatningsdonoren, udvikle sig til voksne, kryds G0 flyver individuelt for at afbalancere dine fluer fra en linje, der passer til den målrettede allel. Bedøve F1 afkom fra hver G0 kors på en kuldioxid pad. Tilfældigt vælge 10 til 20 hanner under et stereomikroskop.Individuelt krydse hver udvalgt mand til en balancer kvinde fra en linje, der passer til den målrettede allel. Når F2 larver luge, vælge F1 far fra hvert kors. Uddrag genomisk DNA ved at klemme hver flue i 10 til 15 sekunder med en pipettespids, der indeholder 50 mikroliter squishing buffer uden at dispensere bufferen.Derefter dispenseres den resterende buffer ind i røret og bland godt. Inkubere ved 37 grader Celsius i 20 til 30 minutter. Efter inkubationen anbringes rørene i 95 grader Celsius varmeblok i et til to minutter for at inaktivere proteinase K.After spinning ned i fem minutter ved 10, 000 gange G, opbevare præparatet ved fire grader Celsius for yderligere PCR-analyse.Udfør tre-trins PCR-baserede skærme ved hjælp af primere frem en og vende en til skærmen for eksistensen af indsættelse eller udskiftning. Udfør PCR ved hjælp af to forreste og bak to primere for at kontrollere indsættelsen eller udskiftningen fra de tre primære område. Udfør PCR ved hjælp af primere M13F og vende tre for at kontrollere ends-in'HDR.Hold fluelinjerne med de bekræftede ends-out'HDR og etablere afbalancerede bestande fra F2-generationen. Out-cross balancer flyver igen for at fjerne eventuelle utilsigtede mutationer på andre kromosomer. Branchless, eller bnl udtryk, er vist her i rødt i den tredje instar larver fløj disk, med receptoren åndeløs udtrykke celler, vist i grønt, i den voksende luftsæk primordium.Branchless udtrykke celler er vist her i TR5 tværgående bindekanal gren og TR2 dorsal gren. Åndeløs udtrykke luftrør celler er vist her i grøn. Åndeløs udtrykkende celler er vist med grønt, mærkning den udviklende embryonale luftrør fra fase ni til fase 14 og branchless udtrykke celler er vist med rødt.Dette billede viser branchless udtryk induceret i ektopisk væv steder under hypoxiske betingelser, i forhold til kontrol. Denne metode er designet til at bevare alle de oprindelige spatiotemporal regler for branchless gen transskription. Derfor var det vigtigt kun at erstatte den første kodning exon af genet med LexA trans aktivator kodning sekvens.Efter sin udvikling banede denne nye genetiske værktøjssæt vejen til at udforske nye vævsudtryksmønstre af det branchless-gen. Det gjorde det også muligt gen mis-udtryk og slået ned udelukkende i branchless udtrykke celler og hjalp med at overvåge lineær migration og signalering interaktioner af cellerne.

En effektiv strategi til at generere væv-specifikke binære transskription systemer i Drosophila af genom-redigering

Abstract