Abstract
Developmental Biology
. המערכות כלים רבי-עוצמה גנטיים בשימוש נרחב עבור להמחיש וטיפול גורל התא והביטוי ג'ין בקבוצות מסוימות של תאים או רקמות אורגניזמים דגם שעתוק בינארי. מערכות אלו מכילות שני רכיבים כשורות נפרדות מהונדס. נהג קו מבטא מפעיל גנים ברמת השעתוק תחת השליטה של רקמות ספציפיות היזמים/מוצרי טיפוח טבעיים, נמלים שורה של הכתב/אפקטור גן המטרה להציב downstream לאתר איגוד של שעתוק activator. חיות מחסה שני הרכיבים לגרום transactivation רקמות ספציפיות של ביטוי גנים היעד. ייתכן ביטוי מדויק של הגן ברקמות יישוב חיוני לפרשנויות לא משוחדת של פעילות התא/ג'ין. לפיכך, פיתוח שיטה ליצירת קווים בלעדיים תא/רקמות ספציפיות הנהג הוא חיוני. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת מערכת ביטוי ממוקד מאוד רקמות ספציפיות על-ידי העסקת "מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר/CRISPR-הקשורים" (CRISPR/Ca)-מבוסס גנום עריכה טכניקה. בשיטה זו, מדריך endonuclease Cas9 מכוון על ידי שניים chimeric RNAs (gRNA) אתרים ספציפיים אקסון קידוד הראשון של גנים בגנום דרוזופילה ליצירת מעברי כפול-סטרנד (DSB). לאחר מכן, באמצעות פלסמיד התורם אקסוגני של המכיל את רצף transactivator, המכונות תיקון תא-אוטונומית מאפשרת תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) של DSB, וכתוצאה מכך למחיקה מדויקת החלפת אקסון עם transactivator רצף. Transactivator הפיל במתבטא אך ורק בתאים איפה חבר העמים-רגולציה מרכיבי הגן הוחלף פונקציונליים. פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט המובאת כאן ליצירת נהג תעתיק בינארי לידי ביטוי דרוזופילה fgf/branchless-הפקת תאים אפיתל עצביים יכולים להיות מאומץ עבור כל ביטוי גנים - או רקמות ספציפיות.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved