אנו מודים יציאת פ ד ר ד ר ק' אוקונור-ג'יילס, ד ר ס פנג לדיונים על אסטרטגיה CRISPR; שחפת ד ר קורנברג, המרכז מניות בלומינגטון ריאגנטים; UMD מתקן דימות הליבה; המימון של NIH: R00HL114867 ו- R35GM124878 כדי האב

1. עיצוב ובניית gRNA את הביטוי וקטור
<ol><li>להחלפת במדויק אזור זמן המוגדר אקסון, להשתמש gRNA כפול הגישה6, שבו כל gRNA במיוחד יעד שני הקצוות של האזור הנבחר של ריבית. כדי לקבל ביטוי גנים ספציפיים ייתכן מדויק של מנהל ההתקן, בחר שני אתרי היעד gRNA בתוך אקסון קידוד הראשון של הגן.</li>
	<li>
דר?...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Lai, S. -. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+targeted+expression+system+for+branchless+and+characterization+of+novel+cellular+expression+patterns+of+the+gene+in+Drosophila.">Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila.</a> Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).</li><li>Doench, J. G., Hartenian, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs.">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li><li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases.">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3. 3 (4), 657-664 (2013).</li><li>Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li><li>Lin, C. -. C., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+Transgenic+DNA+Components+by+Inducible+Gene+Replacement+in+Drosophila+melanogaster.">Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).</li><li>Li, W., K&#246;ster, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control,+modeling,+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR.">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).</li></ol>

באופן מסורתי, מלכודות משפר דרוזופילה נוצרו על ידי שתי שיטות שונות. אחת הדרכים כולל הכניסה אקראי של מנהל התקן (למשל., Gal4) רצף הגנום על ידי טרנספוזיציה (למשל., P-אלמנט טרנספוזיציה)1 . לחלופין, ניתן להציב את רצפי הנהג תחת שליטה תעתיק של אזור משפר בשם/יזם בונה פלסמיד, אשר ...

ארגז הכלים גנטי על ביטוי גנים יישוב פותחה טוב דרוזופילה, שהופך אותו לאחד מערכות המודל הטוב ביותר לחקור את הפונקציה של גנים המעורבים במגוון רחב של תהליכים תאיים. מערכות ביטוי בינארי, כגון שמרים Gal4/UAS (רצף הפעלה נגד הזרם), אומצה תחילה על רקמות ספציפיות משפר השמנה וסדר -ג'ין misexpression מודל גנטי דרוזופילה 1 (איור 1). מערכת זו הקל הפיתוח של מספר רב של טכניקות כגון ויסות זמן-מרחבי של ביטוי גנים, misexpression, נוקאאוט בקבוצות נבחרות של תאים כמו גם כמו אבלציה התא, התא סימון, עקיבה חיה של תאית ומולקולרית תהליכים בתוך העובר, רקמות, מעקב אחר שושלת היוחסין וניתוחים פסיפס במהלך הפיתוח. מספר של מערכת בינארית שעתוק, כגון חיידקי לקסה/לקסהניתוח המערכת (איור 1) ומערכת Neurospora Q-, הם כלים גנטיים רבי-עוצמה נמצאים כעת בשימוש נרחב דרוזופילה, בנוסף מערכת Gal4/UAS המקורי עבור ג'ין יישוב ביטוי1,2,3.
כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מערכת ואמינים רקמות ספציפיות ביטוי בינארי בהחלת טכניקה לעריכת הגנום. הפיתוחים האחרונים בתחום הטכנולוגיה העריכה של הגנום CRISPR/Cas9 אפשרו הזדמנויות חסר תקדים לעריכת שינויים הגנום מכוונת במגוון רחב של אורגניזמים. מערכת CRISPR/Cas9 לעומת אחרים זמינים הגנום טכניקות עריכה, הוא זול, יעיל ואמין. טכנולוגיה זו משתמשת מרכיבי מערכת החיסון מסתגלת חיידקי: Cas9 endonuclease של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת יוצר הפסקה כפולה-סטרנד (DSB), של RNA מדריך chimeric (gRNA), אשר ידריך את Cas9 אל אתר מסוים הגנום עבור יישוב DSB4. התאים מכילים את מכונות כדי לתקן את DSB באמצעות מסלולים שונים. Non-הומולוגי סוף מצטרף (NHEJ) מוביל קטן שהתוספות או המחיקות כדי לשבש את תפקוד הגן, תוך תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) מציג מוגדר ביים/רצוי גנומית ב/דפיקה-את מדהימה באמצעות תורם HDR אקסוגני כתבנית. האסטרטגיה מבוססת-HDR החלפת ביעילות יכול להיות מנוצל כדי ליצור מערכת ואמינים רקמות ספציפיות ביטוי בינארי, אשר ניתן להתגבר על כל המגבלות של השיטות מלכודת משפר מסורתיים. אנו מתארים הליך שלב אחר שלב של ניצול של HDR מבוססת על CRISPR/Cas9 תיקון ביצירת קו הנהג שעתוק בינארי מבוטא תחת השליטה של ויסות גנים ברמת השעתוק והתרגום post-transcriptional אנדוגני של דרוזופילה ג'ין. ב פרוטוקול זה, נדגים את הדור של קו מנהל התקן ספציפי עבור branchless (bnl) ג'ין קידוד החלבון של המשפחה FGF המווסת מורפוגנזה הסתעפות של אפיתל דרכי הנשימה והכו אותי5. בדוגמה זו, אקסון קידוד הראשון של הגן bnl הוחלף על ידי הרצף של רצף transactivator לקסה חיידקי מבלי לשנות כל אנדוגני cis-רצפים הרגולציה של הגן bnl . אנחנו מראים כי האסטרטגיה שנוצר קו נהג bnl-לקסה השולטת spatiotemporally את הביטוי של גנים כתב ממוקם במורד הזרם של LexAoperator (LexAop או LexO) bnl - באופן בלעדי הבעת אפיתל/mesenchymal/תאים עצביים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>X-Gal/IPTG</td>
			<td>Gentrox (Genesee Scientific)</td>
			<td>18-218</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD&#160;244520</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1161</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10977-023</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10%SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>P1190</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210006</td>
			<td>Maxiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCFD4</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>DNA template and vector for gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td>
			<td>Kapa biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5-high fidelity Taq</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #M0491</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #E2611</td>
			<td>DNA assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBPnlsLexA:p65Uw</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DNA template for LexA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR PreMix, with dye (red)</td>
			<td>Sydlab</td>
			<td>MB067-EQ2R</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel elution kit</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-300</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA purification kits</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-330</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E5315S</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lexO-CherryCAAX</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-CD8:GFP</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>btl-Gal4</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MKRS/TB6B</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope SP5X</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Imaging expression pattern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 station</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-122WCU</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ-61</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube homogenizing pestles</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>03-421-217</td>
			<td>genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing

. המערכות כלים רבי-עוצמה גנטיים בשימוש נרחב עבור להמחיש וטיפול גורל התא והביטוי ג'ין בקבוצות מסוימות של תאים או רקמות אורגניזמים דגם שעתוק בינארי. מערכות אלו מכילות שני רכיבים כשורות נפרדות מהונדס. נהג קו מבטא מפעיל גנים ברמת השעתוק תחת השליטה של רקמות ספציפיות היזמים/מוצרי טיפוח טבעיים, נמלים שורה של הכתב/אפקטור גן המטרה להציב downstream לאתר איגוד של שעתוק activator. חיות מחסה שני הרכיבים לגרום transactivation רקמות ספציפיות של ביטוי גנים היעד. ייתכן ביטוי מדויק של הגן ברקמות יישוב חיוני לפרשנויות לא משוחדת של פעילות התא/ג'ין. לפיכך, פיתוח שיטה ליצירת קווים בלעדיים תא/רקמות ספציפיות הנהג הוא חיוני. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת מערכת ביטוי ממוקד מאוד רקמות ספציפיות על-ידי העסקת "מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר/CRISPR-הקשורים" (CRISPR/Ca)-מבוסס גנום עריכה טכניקה. בשיטה זו, מדריך endonuclease Cas9 מכוון על ידי שניים chimeric RNAs (gRNA) אתרים ספציפיים אקסון קידוד הראשון של גנים בגנום דרוזופילה ליצירת מעברי כפול-סטרנד (DSB). לאחר מכן, באמצעות פלסמיד התורם אקסוגני של המכיל את רצף transactivator, המכונות תיקון תא-אוטונומית מאפשרת תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) של DSB, וכתוצאה מכך למחיקה מדויקת החלפת אקסון עם transactivator רצף. Transactivator הפיל במתבטא אך ורק בתאים איפה חבר העמים-רגולציה מרכיבי הגן הוחלף פונקציונליים. פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט המובאת כאן ליצירת נהג תעתיק בינארי לידי ביטוי דרוזופילה fgf/branchless-הפקת תאים אפיתל עצביים יכולים להיות מאומץ עבור כל ביטוי גנים - או רקמות ספציפיות.

פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי ליצור ביטוי בינארי יישוב כתב מערכת ספציפי עבור bnl לבטא תאים5. Cis-אלמנטים רגולטוריות (קרס) כי ייתכן מורכבים bnl הביטוי שליטה לא מאופיינים. לכן, כדי להשיג ביטוי ייתכן תחת השליטה של רצף רגולטורי אנדוגני bnl , רק אקסון קי?...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing at JoVE.com

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי החלפת את אקסון קידוד הראשון של גנים עם מנהלי התקנים של שעתוק. השיטה מבוססת על CRISPR/Cas9 ממקם את רצף transactivator תחת ויסות גנים הוחלף אנדוגני, כתוצאה מכך ומקילה על ההתבטאות transctivator באופן בלעדי בדפוסי ייתכן גנים ספציפיים.

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור מערכת ביטוי ממוקדת ספציפית לרקמות. בשיטה זו, הדגמנו את הדור של נהג שעתוק בינארי ספציפי עבור homolog FGF Drosophila שלנו, ללא ענף. ביטוי דינמי, spatiotemporal של ענף מווסת המוגנזה ענף של אפיתל דרכי הנשימה קנה הנשימה.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה על הביטוי המרחבי והנדידה של תאים מייצרים ללא ענף, ניתן ליישם אותה בקלות על גנים ורקמות אחרים בדרוסופילה או באורגניזמים מודליים אחרים, כגון C.Elegans ו- zebrafish. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת מערכות ביטוי אמינות ביותר, ספציפיות לרקמות ולגנים, ופעילות אך ורק בתאים שבהם האלמנטים הרגולטוריים של הגן המוחלף מתפקדים. מערכות שעתוק בינארי הן כלים חיוניים לביטוי גנים ממוקד ומניפולציה.מפעיל טרנס, כגון GAL4 או LexA, לידי ביטוי תחת שליטה של אלמנטים רגולטוריים cis של גן, כונן גן טרנס משפיע כי הוא ממוקם במורד הזרם של אתרי קשירה שעתוק ספציפיים, כמו UAS עבור GAL4 ו / או LexO עבור LexA. מתודולוגיה זו מחליפה את אקסון הקידוד הראשון של הגן ללא ענף בנהג התמלול. השיטה המבוססת על CRISPR Cas9 מציבה רצף מפעיל טרנס של LexA תחת הרגולציה הא אנדוגנית של הגן ללא ענף, וכתוצאה מכך, מקלה על ביטוי מפעיל טרנס אך ורק בדפוסים מרחביים ספציפיים ללא ענף.התחל על-ידי בחירת שני אתרי יעד RNA מנחה המיועדים באופן ספציפי לשני קצוות של אזור העניין שנבחר. פתח את כלי העיצוב CRISPR לבחירה. כאן נעשה שימוש בממצא היעד האופטימלי של Fly CRISPR.לחץ על בחר גנום'insert רצף של עניין, ובחר את ביאור הגנום Drosophila מלנוגסטר שהועלה לאחרונה, כרגע R מקף תחתון שש, בתפריט הנפתח. לאחר מכן, לחץ על בחר אורך מדריך'ו וקלט 20. בחרו 'כל יעדי CRISPR' ולחצו על 'חפש יעדי CRISPR'.הערך את כל יעדי ה- RNA של מדריך המועמדים על-ידי הגדרת מקסימום עבור מחרוזות ו- NGG בלבד'עבור PAM. כדי ליצור וקטור ביטוי RNA קו מנחה טנדם, PCR הראשון להגביר קטע DNA כדי להציג שני רצפי רווח פרוטו לתוך עמוד שדרה וקטור ביטוי pCFD4 RNA. השתמשו בפריימר קדמי והפוך, כל אחד עם רצף מאריחים פרוטו, וחופפים לרצף הווקטורי pCFD4 ב-PCR באמצעות פולימראז בנאמנות גבוהה ודנ"א תבנית pCFD4.כדי להכין pCFD4 לשיבוט, לעכל את הפלסמיד עם אנזים Bbs1. הגדר תגובה במאגר העיכול המתאים המכיל שניים עד חמישה מיקרוגרם של פלסמיד pCFD4 ומיקרוליטר אחד של אנזים Bbs1 ונפח סופי של 50 מיקרוליטר. מערבבים את תוכן התגובה על ידי ג'נטריפינג הקשה על הצינור ואיסוף כל טיפות מפוזרות מקיר הצינור לתחתית על ידי ספין קצר.הדגירה את תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לאחר הפעלת מוצר PCR פלסמיד מתעכל על ג'ל אגרוז אחוז אחד. לטהר את 6.4 קילו-בסיס זוג פלסמיד ליניארי ו 600 זוג בסיס מוצר PCR באמצעות עמודות טיהור ג'ל סטנדרטי. הגדר את תגובת ההרכבה של הדנ"א לפי פרוטוקול היצרן.עבור חיקוי גנומי של רצף GAL4 או LexA, תכנן תורם HDR דו-תקע המכיל את רצף מפעילי הטרנס, מוקף בשתי זרועות הומולוגיה. כדי למנוע פילוח מחדש של המדריך RNA אל לוקוס מהונדס, לעצב את התורם החלופי באופן כזה אתרי זיהוי RNA המדריך מופרעים על ידי רצף אקסוגני הציג. כמו כן, כדי למנוע שינוי הטוהר של אלמנטים רגולטוריים cis, תמיד לבחור את אתרי זיהוי RNA מדריך בתוך אזור exon קידוד.כדי ליצור קלטת חלופית, תכנן את אסטרטגיית הרכבת הדנ"א כדי לאחד ארבעה מקטעים יחד. חמש זרועות ההומולוגיה העיקריות ושלוש הזרועות ההומולוגיות העיקריות, רצף הדנ"א הטרנסי האקסוגני האמצעי, ועצם השדרה של וקטור השיבוט ליניארי. PCR להגביר GAL4 או קלטת ביטוי LexA מווקטור מתאים PCR להגביר את זרועות הומולוגיה מן ה-DNA הגנומי שחולץ מ קו זבוב האב שנבחר להזרקה.השתמש פולימראז נאמנות גבוהה בכל PCR כדי ליצור את שברי היעד. כדי להגדיר את תגובת ההרכבה של הדנ"א, ערבבו את וקטור השיבוט והשברים היעד ליניאריים שנוצרו על ידי שיבוט PCR עם Mastermix הרכבה DNA ונפח התגובה הסופי ל 20 microliters לפי הוראות היצרן. דגירה תערובת התגובה במשך שעה אחת ב 50 מעלות צלזיוס.כאשר עוברי Nos-Cas9 הוזרקו בעבר הן עם המדריך RNA ביטוי פלסמיד ואת התורם החלופי, להתפתח למבוגרים, לחצות G0 זבובים בנפרד כדי לאזן את הזבובים שלך מ קו מתאים אלל ממוקד. הרדמה של צאצאי F1 מכל צלב G0 על כרית פחמן דו חמצני. בחר באופן אקראי 10 עד 20 זכרים תחת מיקרוסקופ סטריאו.בנפרד לחצות כל זכר נבחר לנקבה מאזנת מ קו מתאים אלל ממוקד. כאשר הזחלים F2 בוקעים, לבחור את האב F1 מכל צלב. יש לחלץ דנ"א גנומי על ידי ריסוק כל זבוב למשך 10 עד 15 שניות עם קצה פיפטה, המכיל 50 מיקרוליטרים של חיץ מעך מבלי לחלק את המאגר.לאחר מכן, מחלקים את החיץ הנותר לתוך הצינור ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, מניחים את הצינורות בבלוק חום של 95 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שתי דקות כדי להשבית את החלבון K.לאחר סיבוב במשך חמש דקות ב 10, 000 פעמים G, לאחסן את ההכנה בארבע מעלות צלזיוס לניתוח PCR נוסף.בצע מסכים מבוססי PCR תלת-שלביים באמצעות פריימרים קדימה אחד והפוך אחד כדי לסנן את קיומו של הכנסה או החלפה. בצע PCR באמצעות שני פריימרים קדימה והפוך שני פריימרים כדי לאמת את הכניסה או ההחלפה משלושת האזורים החדשים. בצע PCR באמצעות פריימרים M13F והפוך שלושה כדי לבדוק את הקצוות'HDR.שמור את קווי הזבוב עם ה- 'HDR של הקצוות המאושרים ובסס מניות מאוזנות מדור ה- F2. החוצה לחצות את המאזן עף שוב כדי להסיר כל מוטציות לא מכוונות על כרומוזומים אחרים. ביטוי ללא ענף, או bnl, מוצג כאן באדום בדיסק כנף הזחלים instar השלישי, עם תאים מבטאים ללא נשימה הקולטן, מוצג בירוק, ב primordium sac האוויר גדל.תאי הבעה ללא ענף מוצגים כאן בסניף החיבור הרוחבי TR5 ובענף הגב TR2. תאי קנה הנשימה חסרי הנשימה מוצגים כאן בירוק. תאים מבטאים חסרי נשימה מוצגים בירוק, מסמנים את קנה הנשימה העוברי המתפתח מהשלב 9 לשלב 14 ותאי ההבעה חסרי הענף מוצגים באדום.תמונה זו מציגה ביטוי ללא ענף המושרה במקומות רקמות חוץ רחמיים בתנאים היפוקסיים, יחסית לשליטה. שיטה זו נועדה לשמור על כל התקנות המרחביות המקוריות של שעתוק גנים ללא ענף. לכן, היה חשוב להחליף רק את exon הקידוד הראשון של הגן עם רצף קידוד מפעיל טרנס LexA.לאחר התפתחותה, כלים גנטיים חדשים אלה סללו את הדרך לחקור דפוסי ביטוי רקמה חדשניים של הגן ללא ענף. היא גם אפשרה ביטוי שגוי של גנים והפלה בלעדית בתאי הבעה ללא ענף ועזרה בניטור הגירה ליניארית ואינטראקציות איתות של התאים.