Una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila genoma modificando

Sistemi di trascrizione binario sono potenti strumenti genetici ampiamente usati per la visualizzazione e manipolazione cellulare destino e l'espressione genica in specifici gruppi di cellule o tessuti in organismi modello. Questi sistemi contengono due componenti distinte linee transgeniche. Un'autista linea esprime un attivatore trascrizionale sotto il controllo di promotori tessuto-specifici/Enhancer, un reporter/effettrici linea porticcioli e un gene bersaglio posizionato a valle per il sito di legame dell'attivatore di trascrizione. Animali che harboring entrambi i componenti inducono la transattivazione di tessuto-specifica di un'espressione di gene di destinazione. Spazio-temporale precisa espressione del gene in tessuti mirati è critica per interpretazione imparziale dell'attività del gene e delle cellule. Di conseguenza, lo sviluppo di un metodo per la generazione di linee di esclusivo cellula/tessuto-specifico driver è essenziale. Qui presentiamo un metodo per generare il sistema di espressione mirati altamente tessuto-specifica con l'ausilio di un "cluster regolarmente Interspaced breve palindromi Repeat/CRISPR-associated" (CRISPR/Cas)-base tecnica di editing genomico. In questo metodo, l'endonucleasi Cas9 è bersagliato da due chimerico guida RNAs (gRNA) a siti specifici nel primo esone codifica di un gene nel genoma della drosofila per creare rotture a doppio filamento (DSB). Successivamente, utilizzando un plasmide di donatore esogeno contenente la sequenza di transactivator, il macchinario di riparazione delle cellule-autonoma consente il ripristino diretto di omologia (HDR) del DSB, con conseguente eliminazione precisa e sostituzione dell'essone con il transactivator sequenza. Il transactivator bussò-in è espresso esclusivamente in cellule dove il cis-elementi regolatori del gene sostituito sono funzionali. Il protocollo dettagliato passo-passo qui presentato per la generazione di un driver binario trascrizionale espresso in Drosophila fgf/prive-producendo le cellule epiteliali/neuronali può essere adottato per qualsiasi espressione di gene - o tessuto-specifico.