Ce travail a été soutenu par une subvention SBIR (1R44EY027654-01 a 1).

Toutes les procédures sur des souris ont été réalisés conformément aux protocoles approuvé par la Commission des enfants Hospital Oakland Research Institute animale soin et l’utilisation et ont adhéré à l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) instruction pour l’utilisation des animaux en ophtalmologie et recherche de vision.
1. tissu préparation pour Immunostaining
<ol><li>Euthanasier souris C57 BL/6J à jour embryonnaire (E) 16, jour après la naissance (P) 0, P15 et P90 de dioxyde de carbone (CO2) suivi par décapitation (souris E16 et P0).</li>
	<li>Yeux de souris immédiatement enucleate perforer avec aiguille de 29 1/2 sur la face dorsale de le œil. Incuber pendant 5 minutes (min) dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) du pH d’une solution saline tamponnée au phosphate (solution de 1 PBS x) 8.0 à température ambiante.</li>
	<li>Pour rendre œilleton de P0, P15 et P90, disséquer sur la cornée et lentilles avec des ciseaux fins ophtalmiques, tandis que les yeux est dans les 4 % PFA. NOTE : Sauter cette étape pour E16 yeux que les yeux sont trop petits.</li>
	<li>Fixer le œilleton (P0, P15 et P90) et les yeux ensemble (E16) dans 4 % PFA pendant 20 min à température ambiante. Puis laver le œilleton et yeux ensemble deux fois dans 1 mL de PBS 1 x pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Cryoprotect l’oeil tasses et les yeux tout en 1xPBS, pH 8,0 contenant 10 % de sucrose pendant 1 heure. Gardez à 20 % de sucrose dans du PBS 1 x pendant 1 heure et puis saturer dans 30 % de saccharose dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Le lendemain, incorporer le œilleton et les yeux tout dans une coupe optimale température composé (OCT), (500 µL) dans cryomolds, clin d’oeil-gel dans un bain de glace carbonique/éthanol et conserver à-80 ° C.</li>
	<li>Retirer les moules avec œilleton intégré et yeux entiers de-80 ° C et laisser se pour équilibrer à-20 ° C pendant 1 heure avant cryosectioning.</li>
	<li>Coupe des coupes rétinienne (12 µm d’épaisseur) parallèlement à l’axe de temporonasal dans la tête du nerf optique à l’aide d’un cryostat à-20 ° C.</li>
	<li>Monter les sections rétiniennes sur microscope slides53 et conserver à-80 ° C.</li>
</ol>2. immunohistochimie avec des anticorps 5-mC et 5-hmC
<ol><li>Encercler les sections rétiniennes montées sur des lames avec un stylo de barrière hydrophobe. La plume de barrière hydrophobe réduit le volume des anticorps nécessaires pour colorer les tissus.</li>
	<li>Laver les sections rétiniennes une fois avec 200 µL de PBS 1 x pendant 10 min.</li>
	<li>Permeabilize les sections rétiniennes avec 200 µL de 0,1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x (PBS-T) pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Dénaturer les sections rétiniennes pour 30 min à 200 µL de fraîchement préparés 2 N d’acide chlorhydrique (HCl) dans du PBS 1 x dans un incubateur à 37 ° C. NOTE : Attention titrage de HCl traitement est nécessaire pour optimiser le signal 5mC.</li>
	<li>Incluez toujours les réplicats biologiques (3-4) tout en optimisant 5mC signal54. NOTE : Nous avons fait la recherche d’antigène à 4 points de temps (15 min, 30 min, 1 h et 2 h) et a trouvé 30 min d’incubation est optimale pour signal 5mC. Une incubation plus longue avec du HCl dégrade la structure des noyaux conduisant à l’incapacité de localiser 5mC signal au noyau.</li>
	<li>Après dénaturation, neutraliser les sections rétiniennes en ajoutant 100 µL de 0,1 M Tris-HCl (pH 8,3) sur des coupes de rétiniens pendant 10 min.</li>
	<li>Incuber les sections de 500 µL de solution de blocage (5 % de sérum de chèvre normal preimmune dans 0,1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x) pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humide.</li>
	<li>Après le blocage, ajouter anti-5mC ; anticorps anti-5hmC dilué à 1/500 en bloquant la solution aux sections rétiniennes.</li>
	<li>Incuber le rétinal sections pendant la nuit à 4 ° C en chambre humide.</li>
	<li>Le prochain jour lavage, rétiniennes sections 3 fois (10-15 min chaque fois) avec 0,1 % PBS-T et puis incuber en bloquant la solution avec l’anticorps secondaires correspondants (chèvre anti-lapin et Goat anti-mouse IgG, dilué ; 1/1000), contenant le DAPI (4', 6 - solution (1 µg/mL) à la température ambiante pendant 1 h en bloquant la solution de diamidino-2-phénylindole). NOTE : Éviter le séchage des sections durant toutes les étapes d’immunodétection.</li>
	<li>Laver les lames trois fois avec 1 mL de 0.1 % PBS-T.</li>
	<li>Après le dernier lavage, monter les sections avec milieu de montage aqueux sous un lamelle couvre-objet et sceller avec du vernis à ongles incolore.</li>
</ol>3. confocal immunohistochimie
<ol><li>Orienter les sections pour que le côté de l’épithélium pigmentaire rétinien de la cupule optique toujours face à un sens (par exemple, vers le haut), par souci de cohérence.</li>
	<li>Effectuer la capture d’image d’immunomarquage rétinienne sections 63 X (grossissement de l’objectif) avec 2 X ou 3 X zoom.</li>
	<li>Générer plusieurs sections optiques de chaque image sélectionnée (z-piles) dans tous les 3 canaux (rouge, vert et bleu, RVB) à l’aide de 0,35 µm étape. Remarque : Le grossissement final d’un spécimen visualisé à 10-20 X (grossissement de l’objectif) sera de 63 X, respectivement, lorsqu’il est combiné avec un (généralement utilisé) 10 X lentille oculaire. Visualiser la pile compressée en optique pour localiser le signal 5mC et 5hmC</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Hydroxymethylation et la méthylation de l’ADN sont dynamiques et réversibles ADN modifications, qui vont de diverses modulatethe des mécanismes biologiques dans un pays en développement ainsi que dans les cellules postmitotiques. Ici, nous décrivons une technique reproductible pour détecter 5mC et 5hmC ADN modifications in situ par technique immunohistochimique (utilisant des anticorps anti-5mC et anti-5hmC) dans les coupes congelées paraformaldéhyde-correction de la rétine de souris et de fournir lignes directrices pour améliorer et de normaliser les résultats, surtout lorsqu’on compare plusieurs spécimens différents. Nous précédemment utilisé cette méthode pour délimiter 5mC changements dans la rétine de souris avec la rétine spécifiques ciblant de Dnmt1, Dnmt3a et Dnmt3b gènes de l’ADN méthyltransférase et signalé l’épuisement (attendu) des marques 5mC dans leurs rétines7 .
L’étape critique de détection immunohistochimique 5mC est l’optimisation du traitement des coupes histologiques avec HCl : moins de 15 min un prétraitement ne devrait pas produire des résultats reproductibles, alors qu’un traitement excessif avec HCl détruit le nucléaire architecture. Nous avons trouvé le meilleur résultat après 30 min d’incubation avec HCl. Nous recommandons d’utiliser toujours des HCl fraîchement diluée et fraîchement préparée solution PFA à 4 % pour la fixation du tissu de dénaturation et de la rétine ADN.
Pour dépanner les résultats, nous recommandons d’inclure trois ou quatre réplicats biologiques tout en optimisant le signal 5mC. Alors que la valeur de chaque individu de coloration immunohistochimique peut générer des résultats légèrement différents (plus ou moins lumineuses régions hétérochromatiques), qui est attendu en immunohistochemical méthode, 5mC et 5hmC distribution nucléaire au sein de l’ensemble des des articles devrait être très reproductible, pour aussi longtemps que le protocole est respecté.
Cette technique a également limitation que nous avons constamment observé la variabilité 5mC distribution dans les noyaux des cellules photoréceptrices dans la même section. Nous avons trouvé quelques noyaux a montré fort 5mC signal tandis que les noyaux de la cellule adjacente n’affiche aucun signal de 5mC. C’est en raison de la limitation à démasquer 5mC antigène par traitement de HCl dans les coupes congelées.
L’importance de cette technique permet la localisation 5mC sans DNase et la protéinase K traitement conduisant à une meilleure préservation des chromocentres. Cette technique est censée travailler vigoureusement sur toutes les sections de tous les tissus animaux vertébrés, comptable 5mC, 5hmC marques et traitée avec une approche similaire, non seulement rétine de souris, pour aussi longtemps que le protocole est respecté.

Régulation épigénétique du développement et l’homéostasie mitotiques de rétine de souris sont un domaine passionnant de recherche, qui promet d’apporter une nouvelle compréhension des mécanismes biologiques contrôlant la détermination sort retinogenesis et cellule, spécifiques à un type de cellules fonction métabolique ainsi que des pathologies cellulaires, la mort cellulaire et régénération1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. la chromatine subit des changements dynamiques dans le développement, ainsi qu’en réponse à des signaux variables externes que ce soit le stress, métabolique ou mort des stimuli6,14,15, de cellules 16 , 17 , 18. dans les noyaux de la souris, la chromatine est divisée en euchromatine actif et inactif hétérochromatine6,19,20. Dans le noyau interphasique, euchromatine réside dans la région interne du noyau alors que hétérochromatine tapisse la périphérie nucléaire et le nucléole. Ce modèle est appelé classique et est hautement conservé chez les eucaryotes. En revanche, les noyaux de tige chez les animaux nocturnes tels que les souris et le rat ont inversé modèle où le noyau est occupé par l’hétérochromatine au centre entouré d’euchromatine formant la coque ultrapériphériques6,18, 20. À la naissance, noyaux de la tige ont architecture nucléaire conventionnel. Inversion des noyaux de la tige se produit au cours du développement de remodelage de l’architecture nucléaire conventionnel. Au cours de ce processus, hétérochromatine périphérique se sépare de la périphérie nucléaire et chromocentres fusionnent pour former un chromocentre unique dans le centre du noyau6,18.
Méthylation de l’ADN génomique participe au contrôle de conformation de la chromatine local21. Méthylation de l’ADN se produit à la position 5' des résidus cytosine des dinucléotides enrichis dans la région promotrice de nombreux gènes chez la souris génomes22,23,24,25,26 ainsi que dans intergéniques et régions intron, qui transportent des éléments régulateurs27. La méthylation des îles de CpG en proximal promoteurs21,24 et séquences CpG dans le gène exhausteurs27,28 est importante dans la régulation de l’état dynamique de la chromatine bivalente, contenant de nombreux facteurs de développement gènes/transcription jouant un rôle important dans le développement, le cancer et vieillissement29,30,31,32,33,34 . Trois ADN méthyltransférases (DNMTs) participent à la méthylation de l’ADN au cours du développement de souris35. Tous les trois DNMTs sont expriment au cours de la souris développement rétinienne36 et les changements spécifiques rétine Dnmt gènes impact rétinien développement2,7. Hydroxyméthylcytosine (5hmC) est le produit oxydant de la déméthylation de la 5-méthylcytosine (5mC). Les trois enzymes de Translocation (TET) de dix-onze participent 5mC déméthylation37,38,39. Modification de l’hydroxyméthyl-C est enrichie en promoteurs, organismes de gène et intergéniques séquences génomiques dans les gènes riche et régions transcrites activement27,40.
Il y a une variété d’approches décrites pour déterminer l’évolution méthylation de l’ADN dans les cellules41,42,43,44,45,46, permettant à certains d'entre eux quantifier les changements globaux de méthylation de l’ADN tandis que d’autres en se concentrant sur les changements précis dans les régions riches en CpG au sein des promoteurs et exhausteurs. Méthodes de détection et de quantification des 5hmC ont également étaient signalés47, y compris par immunohistochimie13. Des techniques immunohistochimiques, permettant un contrôle robuste des changements 5mC et 5hmC dans les noyaux de développer et de cellules postmitotiques, sont très instructifs pour délimiter la chromatine dynamics in situ en réponse aux changements internes ou externes impact sur les cellules4,13,48,49. Toutefois, cette approche est encline à sous-estimer la méthylation de l’ADN et les changements de hydroxymethylation en raison de difficultés techniques, associées à la détection des modifications de cytosine dans les préparations histologiques. C’est parce que les bases de l’ADN non polaire, y compris 5mC et cytosine 5hmC modifiés, sont cachés au sein du Centre des ADN double-brin hélice50et nécessitent la mise à nu. C’est particulièrement difficile dans les préparations histologiques congelées, qui peuvent perdre rapidement informative organisation du tissu original lorsque le traitement rigoureux est appliqué.
La rétine de souris est un excellent modèle pour disséquer la contribution de méthylation de l’ADN au développement neurologique et homéostasie mitotiques. Il y a seulement 6 types de neurones (tiges et cônes photorécepteurs, amacrines, des cellules bipolaires, horizontale et ganglion), une cellule gliale type (glia Muller) et une neuroépithéliales cellule type (épithélium pigmentaire rétinien)51. Types de cellules rétiniennes auraient ont des profils distincts de DNA methylation18,19, qui a récemment été étudiée à base unique résolution1,5,9,12. Nous avons récemment rapporté immunohistochimie demande à délimiter 5mC patron de distribution dans les noyaux des cellules rétiniennes et des changements dans le noyau de la rétine de souris adultes, où tous les trois ADN méthyltransférases ont été supprimées en ciblant conditionnelle 7. par rapport à un certain nombre de rapports, où la présence de méthylation de l’ADN dans les cellules de la rétine pourrait être considérée seulement comme un positif, ou le signal négatif en fait les cellules en apoptose, notre approche activé la détection spécifiques de chromatine arrangement dans les noyaux des cellules rétiniennes, qui nous et plusieurs groupes signalés et nous l’avons vu5,6,7,18,19,36 , 52. nous décrivons ici la technique d’immunohistochimie (IHC) de détecter 5mC et 5hmC dans les coupes histologiques paraformaldéhyde-correction congelées en détails ainsi que le démontrent les données, que nous avons pu reproduire de notre rapport initial7 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29G1/2 ULTRA-FINE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissor</td>
			<td>Fine Science tools, Inc.&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>RPICORP.com</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslide Superfrost plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N HCl</td>
			<td>VWR analytical&#160;</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.3</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mC</td>
			<td>Genway Biotech&#160;</td>
			<td>GWB-BD5190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5hmC</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaminB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab16048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-225-1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-585-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRM HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>388114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

L’épigénétique du développement rétinienne est un domaine de recherche bien étudiée, ce qui promet d’offrir un nouveau niveau de compréhension des mécanismes d’une variété de maladies dégénératives rétiniennes et identifier de nouvelles approches de traitement. L’architecture nucléaire de rétine de souris est organisé en deux modèles différents : classique et inversée. Modèle classique est universel où l’hétérochromatine est localisée à la périphérie du noyau, tandis que l’euchromatine active se trouve à l’intérieur du nucléaire. En revanche, modèle nucléaire inversé est unique pour les noyaux des cellules photoréceptrices tige adulte où hétérochromatine se localise au centre nucléaire, et euchromatine réside dans la périphérie nucléaire. Méthylation de l’ADN est principalement observée dans chromocentres. Méthylation de l’ADN est une modification covalente dynamique sur les résidus de cytosine (5-méthylcytosine, 5mC) des dinucléotides enrichis dans les régions promotrices des gènes nombreux. Trois ADN méthyltransférases (DNMT1, DNMT3A et DNMT3B) participent à la méthylation de l’ADN au cours du développement. 5mC détection avec des techniques immunohistochimiques est très difficile, contribuant à la variabilité dans les résultats, comme toutes les bases de l’ADN y compris les bases de 5mC modifiés sont cachés dans l’hélice d’ADN double brin. Toutefois, le tracé détaillé des 5mC distribution au cours du développement est très instructif. Ici, nous décrivons une technique reproductible pour détection immunohistochimique robuste 5mC et un autre épigénétique ADN marqueur 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), qui permet avec la chromatine « ouverte », transcriptionnellement active dans l’élaboration et rétine de souris ici.

Pour déterminer la distribution de la 5-méthylcytosine (5mC) et 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) au cours du développement rétinienne et dans la rétine mitotiques, nous immunomarquage C57BL/6J rétinienne section mouse E16, P0, P15 et P90 avec des anticorps spécifiques à 5mC et 5hmC.
À E16 la coloration 5mC était forte en chromocentres des noyaux cellulaires, tandis qu’une coloration faible a été observée dans les noyaux des cellules entières (Figure 1 a). La coloration à le 5hmC était limitée aux noyaux cellulaires et était absente de la chromocentres (Figure 1 b).
Dans la rétine de P0, le signal de 5mC a été localisé à chromocentres des noyaux cellulaires et périphérie nucléaire (Figure 2 a, flèche et pointe de flèche). Nous avons également observé une coloration faible de 5mC entre chromocentres des noyaux cellulaires. Le signal de 5hmC est fortement présent dans le noyau de la cellule à l’exception de chromocentres (Figure 2 b). Nous avons trouvé que plusieurs noyaux sont tachées 5mC et 5hmC dans la couche intérieure neuroblastes (INBL) (Figure 2c, pointillé)
Dans la rétine P15, nous avons trouvé forte coloration de 5mC et 5hmC en couche nucléaire externe (ONL), couche nucléaire interne (INL) et couche de cellules de ganglion (GCL) (Figure 3). En ONL (photorécepteurs de la tige), le signal de 5mC était présent dans le chromocentres des noyaux cellulaires et périphérie nucléaire (Figures 3 a-3C, 3 g). Le signal de 5hmC a été trouvé dans les noyaux des cellules entières à l’exception de chromocentres (Figures 3d-3f). La microscopie électronique à transmission faite P15 rétine montre la répartition des domaines hétérochromatiques dans les noyaux de cellules de tige semblable à celle trouvée avec signal d’anticorps 5mC (Figures 3 h et 3i).
La coloration de 5mC INL et GCL a été forte en chromocentres des noyaux cellulaires et faible coloration s’observe également dans les noyaux de cellules entières (Figures 3j-3 l et 3r-3 t). Contrairement à 5mC, le signal de 5hmC a été localisé dans les noyaux de cellules entières à l’exception de chromocentres INL et GCL (Figures 3M-3o et 3u-3w). Nous avons observé forts signal de 5hmC à la périphérie des noyaux cellulaires GCL.
Dans photorécepteurs de la tige adulte, le signal 5mC se limitait à la chromocentre et la périphérie nucléaire des noyaux cellulaires (Figures 4 a-4C), tandis que le signal de 5hmc se limitait à la périphérie nucléaire (Figures 4 d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> La figure 1. Localisation de la 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine dans la rétine de souris à embryonnaire jour 16. Immunomarquage de rétine C57BL/6J avec anticorps anti-5mC (rouge, a) et 5hmC (vert, b). E16, 5mC signal est très fort en chromocentres des noyaux cellulaires et également présents dans les noyaux des cellules entières au niveau beaucoup plus faible. 5hmC coloration se limitait exclusivement aux noyaux cellulaires. C panneau représente 5mC fusionnée et 5hmC image. Les noyaux sont Eosine au DAPI (bleu, c). Encarts représentent un grossissement de parcelle avec astérisque dans les images. Barre d’échelle : 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> La figure 2. Le marquage immunohistochimique de la 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine dans la rétine de souris à jour après la naissance 0. Immunomarquage de rétine C57BL/6J avec anticorps anti-5mC (rouge, a) et 5hmC (vert, b). Dans la rétine de P0, 5mC et 5hmC sont présents en couche extérieure neuroblastes (ONBL) et couche intérieure neuroblastes (INBL). ) un 5mC signal est fortement présent dans le chromocentres (flèche) et de la périphérie nucléaire des noyaux cellulaires (pointe de flèche). Faible coloration de 5mC est aussi observée entre chromocentres des noyaux cellulaires. b) 5hmC coloration se limite au noyau de la cellule et signal fort on observe INBL (ligne en pointillés dans le groupe c). C panneau représente 5mC fusionnée et 5hmC image. Les noyaux sont Eosine au DAPI (bleu, c). Encarts représentent un grossissement de parcelle avec astérisque dans les images. Barre d’échelle : 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> La figure 3. 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine distribution dans la rétine de souris à jour après la naissance, 15. Immunomarquage de C57BL/6J rétine avec des anticorps anti-5mC et 5hmC (a à g, j-y). Dans la couche nucléaire externe (ONL) (photorécepteurs de la tige), 5mC signal (rouge, un) habituellement coïncide avec la chromocentres des noyaux cellulaires (pointe de flèche, b) et aussi se localise à la périphérie nucléaire (flèche, b). Groupe b (rouge) et c (gris) représentent un grossissement de parcelle avec astérisque dans l’image une. Le signal de 5hmC (vert, d) se limite au noyau de cellules entières à l’exception de chromocentres. Groupe e (vert) et f (gris) représentent un grossissement de parcelle avec astérisque dans l’image d. panneau g représente 5mC fusionnée et 5hmC image. Les noyaux sont Eosine au DAPI. Groupe h et moi sommes image de microscopie électronique de transmission des noyaux de photorécepteur à distribution montrant le jour après la naissance 15 domaines hétérochromatiques. Arrowhead noir en panneau h points à simple tige photorécepteur noyau agrandi en panneau i. flèches rouges en panneau que j’ai pointer vers des domaines hétérochromatiques dans noyau photoréceptrices tige tandis que les flèches rouges pointent vers hétérochromatine dans la périphérie nucléaire. INL (j-q) et les noyaux des cellules GCL (r-y), le signal de 5mC (rouge) est localisé à chromocentres présents dans la périphérie et coloration faible est également détectée dans le reste des noyaux cellulaires. Groupe k (rouge) et moi (gris) représentent un grossissement de parcelle avec astérisque dans l’image de j. La coloration de 5hmC (vert) dans les noyaux cellulaires INL et GCL est confinée au noyau de cellules entières. Noter 5hmC forte coloration à la périphérie nucléaire des cellules GCL. X et p panneau représentent 5mC fusionnée et 5hmC image tandis que y et q groupe représentent un grossissement de parcelle avec astérisque dans l’image p et x, respectivement. Les noyaux sont Eosine au DAPI. Barre d’échelle : 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> La figure 4. 5-méthylcytosine 5-hydroxyméthylcytosine distribution et dans les noyaux de photorécepteur tige de rétine de souris C57BL/6J à jour après la naissance 90. La coloration de 5mC (rouge, un) est fortement présent dans le chromocentre des noyaux cellulaires et également faiblement présent dans la périphérie nucléaire. Groupe b (rouge) et c (gris) représentent un grossissement de parcelle avec astérisque dans l’image une. La coloration à le 5hmC (vert, d) est exclusivement limitée à la périphérie nucléaire panneau e (vert) et f (gris) représentent grossissement de parcelle avec astérisque dans l’image d. panneau g représente 5mC fusionnée et 5hmC image tout en panneau h est un grossissement de parcelle avec astérisque dans l’image que g. noyaux sont Eosine au DAPI (bleu). Barre d’échelle : 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

La détection immunohistochimique de la 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine dans l’élaboration et de la rétine de souris ici

L’objectif de ce rapport est de décrire le protocole pour la détection immunohistochimique robuste de marqueurs épigénétiques, 5-méthylcytosine (5mC) et 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) dans le développement et postmitotiques rétine de souris.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

This method can help answer key questions in the DNA methylation field, such as changes in chromatin during retinal development in postmitotic retina. The main advantage of this technique is that it can be used robustly on any sections from all mouse retina tissues carrying 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine distribution that are processed in a similar approach. Visual demonstration of this method is critical as the tissue preparing and staining steps are difficult to learn, because if frozen histological preps are being used, valuable organizational and original tissue can be lost.Demonstrating the rest of the procedure will be Pablo Diaz, research associate from our laboratory. To start this procedure, use a 29 gauge one half inch needle to puncture the eyes of a decapitated euthanized mouse on the dorsal side of the eyes. To obtain eye cups, immediately enucleate the eyes by cutting around the sclera with fine ophthalmic scissors to remove the cornea and the lens.Fix the eye cups and E16 whole eyes in 4%paraformaldehyde or PFA in 1xPBS pH 8.0 for 20 minutes at room temperature. Wash them twice in one milliliter of 1xPBS at room temperature for 10 minutes. To cryoprotect the eye cups and whole eyes, incubate them in 1xPBS pH 8.0 with 10%sucrose at room temperature for one hour.Then in 20%sucrose in 1xPBS for one hour. And finally in 30%sucrose in 1xPBS at 4 degrees Celsius overnight. On the following day, embed the eye cups and eyes in optimal cutting temperature compound, or OCT, in cryomolds.Then snap freeze them in a dry ice ethanol bath and keep at 80 degrees Celsius. Prior to starting cryosectioning, remove the molds with embedded eye cups and eyes from 80 degrees Celsius. Place them in a cryostat holder and allow them to equilibrate to 20 degrees Celsius for one hour.Using a cryostat at 20 degrees Celsius, cut 12 micrometer thick retinal cross sections parallel to the temporonasal axis through the optic nerve head. Mount the sections on microscope slides and store at 80 degrees Celsius. To start immunostaining, use a hydrophobic barrier pen to encircle the retinal sections mounted on slides.Wash the sections once with 200 microliters of 1xPBS for 10 minutes. Permeabilize the sections with 200 microliters of PBST for 10 minutes at room temperature. Then denature them with 200 microliters of freshly made carefully titrated 2 Normal hydrochloric acid in 1xPBS for 45 minutes at 37 degrees Celsius to optimize 5mC signal.After denaturation, add 100 microliters of 0.1 Tris-HCl pH 8.3 on the retinal sections, and incubate for 10 minutes at room temperature to neutralize them. Then, add 500 microliters of blocking solution. And incubate the sections in a humidity chamber at room temperature for one hour.Add the appropriate antibodies, diluted one to 500 in blocking solution, to the sections and incubate overnight at four degrees Celsius. On the following day, wash the sections three times for 10 to 15 minutes each with 0.1%PBST. Add appropriate secondary antibodies diluted one to 1000 in blocking solution containing DAPI solution at room temperature for one hour.Next, wash the slides three times with one milliliter of 0.1%PBST for 10 minutes each. After the last wash, add aqueous mounting medium. Cover with a coverslip.And then proceed with confocal microscopy. After retinal immunostaining at E16, 5mC signal was strong in chromocenters of the cell nuclei and present at a much lower level in the whole cell nuclei. 5hmC staining was exclusively found in the cell nuclei and absent from the chromocenters.In P0 retina, both 5mC and 5hmC signals were present in the outer neuroblast layer, and inner neuroblast layer. 5mC signal was strong in the chromocenters and nuclear periphery of the cell nuclei, and weaker in between the chromocenters of cell nuclei. 5hmC staining was restricted to the cell nucleus.In P15 retina, in the outer nuclear layer, 5mC signal was detected in the chromocenters of the cell nuclei and nuclear periphery. Whereas 5hmC signal was in the whole cell nuclei except for the chromocenters. In the inner nuclear, and ganglion cell layer, 5mC signal was strong in the chromocenters of the cell nuclei, and weak in whole cell nuclei.Whereas the 5hmC signal was found in the whole cell nuclei except for the chromocenters. In adult rod photoreceptors, the 5mC signal was limited to the chromocenter and nuclear periphery, whereas 5hmC signal was restricted to the nuclear periphery. While attempting this procedure, it's important to remember to treat histological sections with the optimal exposure of HCl, which is 30 minutes.If the exposure is less or more, then optimal results can not be reproducible. Following this procedure, other methods, like high pressure liquid chromatography, mass spectrometry can be performed in order to answer additional questions like quantification of changes in measuring 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of neural development to explore epigenetic changes in chromatin.Don't forget that working with HCl and PFA can be extremely hazardous, and precautions, such as proper disposal, should always be taken while performing this procedure.