עבודה זו נתמכה על ידי מענק SBIR (1R44EY027654-01A1).

כל ההליכים עם עכברים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על-ידי החולים אוקלנד המכון לחקר בעלי חיים טיפול ושימוש הוועדה של הילדים, דבקה האגודה למחקר בהצהרת חזון, רפואת עיניים (ארוו) לשימוש חיות אופטלמולוגיות ועל חזון המחקר.
1. רקמות הכנה Immunostaining
<ol><li>המתת חסד C57 BL/6J עכברים ביום עובריים (E) 16, יום לאחר הלידה (P) 0, P15 ו P90 על ידי פחמן דו חמצני (CO2) ואחריו עריפת ראש (עכברים E16, P0).</li>
	<li>עכבר מיד enucleate העיניים ניקב עם המחט 29G 1/2 בצד הגבי של העין. תקופת דגירה של 5 דקות (דקות) ב 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) בבאגירה פוספט תמיסת מלח (1 x PBS) pH 8.0 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כדי להפוך את העין כוסות מן P0, P15 P90, שווייץ קרנית, עדשה עם מספריים אופטלמולוגיות בסדר בעוד העיניים % 4 מחברים. הערה: לדלג על שלב זה עבור העיניים E16 עיניו הם קטנים מדי.</li>
	<li>לתקן את כוסות העין (P0, P15 P90), כל העיניים (E16) ב 4% מחברים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את העין כוסות, עיניו כל פעמיים ב 1 מ"ל של PBS 1 x 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Cryoprotect העין כוסות, כל העיניים ב 1xPBS, pH 8.0 המכיל 10% סוכרוז למשך שעה. לשמור על 20% סוכרוז ב- PBS 1 x 1 שעה וירווה ואז ב- 30% סוכרוז ב- PBS 1 x לילה ב 4 º C.</li>
	<li>למחרת, להטביע את הכוסות עיניים והעיניים כל אופטימלית טמפרטורה תרכובת חיתוך (אוקטובר), (500 µL) ב cryomolds snap-הקפאת באמבט קרח יבש/אתנול, לאחסן ב- 80 ° c</li>
	<li>להסיר את התבניות עם העין מוטבע כוסות ועיניים כל-80 ° C, מאפשרים equilibrate ל-20 ° C עבור שעה אחת לפני cryosectioning.</li>
	<li>לחתוך חתכי רוחב ברשתית (בעובי 12 מיקרומטר) במקביל לציר temporonasal דרך ראש עצב הראייה באמצעות cryostat ב-20 ° C.</li>
	<li>הר מקטעי רשתית על שקופיות מיקרוסקופ53 וחנות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. Immunostaining עם נוגדנים 5-mC, 5-hmC
<ol><li>להקיף את המקטעים ברשתית רכוב על שקופיות עם עט הידרופובי המכשול. העט הידרופובי המכשול מפחיתה את עוצמת הקול של נוגדן הנדרש כדי להכתים את הרקמה.</li>
	<li>לשטוף את המקטעים ברשתית פעם אחת עם 200 µL 1 x PBS למשך 10 דקות.</li>
	<li>Permeabilize הסעיפים ברשתית עם 200 µL של 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS (PBS-T) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Denature מקטעי רשתית למשך 30 דקות עם 200 µL של טריות חומצת מלח (HCl) N 2 ב 1 x PBS ב חממה 37 ° C. הערה: טיטור זהיר של HCl טיפול נחוץ כדי למטב את האות 5mC.</li>
	<li>תמיד כוללים ביולוגי משכפל (3-4) תוך אופטימיזציה 5mC אות54. הערה: עשינו אנטיגן אחזור ב- 4 נקודות זמן (15 דקות, 30 דקות, 1 h ו- 2 h), והוא נמצא 30 דקות הדגירה אופטימלי איתות 5mC. זמן הדגירה עם HCl השתנה המבנה של גרעינים שמוביל לחוסר יכולת לבצע לוקליזציה אות 5mC את הגרעין.</li>
	<li>לאחר דנטורציה, לנטרל סעיפים רשתית על-ידי הוספת µL 100 של 0.1 M טריס-HCl (pH 8.3) על הרשתית מקטעים עבור 10 דקות.</li>
	<li>דגירה בסעיפים 500 µL של חסימת פתרון (5% סרום preimmune עז רגילה ב- 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS) לשעה בטמפרטורת החדר בתוך תא לחות.</li>
	<li>לאחר חסימת, להוסיף אנטי-5mC; נוגדנים אנטי-5hmC מדולל שבערך בחסימה לפתרון הסעיפים ברשתית.</li>
	<li>דגירה רשתית מקטעים לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא לחות.</li>
	<li>כביסה היום הבא, מקטעי רשתית 3 פעמים (10-15 דקות כל פעם) עם 0.1% PBS-T ואז דגירה בחסימה פתרון עם נוגדנים משניים המתאים (אנטי-ארנב עז, עז העכבר אנטי אג, מדולל; 1:1000), המכיל דאפי (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) פתרון (1 µg/mL) בטמפרטורת החדר במשך 1 h בחסימה פתרון. הערה: למנוע ייבוש סעיפים בכל שלבי immunodetection.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות בפעם השלישית עם 1 מ"ל של 0.1% ל- PBS-טי</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה הר הסעיפים מימית הרכבה בינונית תחת coverslip, לאטום עם לק שקוף.</li>
</ol>3. אימונוהיסטוכימיה קונאפוקלית
<ol><li>אוריינט הסעיפים יש את הצד אפיתל הפיגמנט ברשתית של גביע אופטיים פונה תמיד דרך אחת (למשל, למעלה), עקביות.</li>
	<li>לבצע לכידת התמונה סעיפים immunostained רשתית-63 X (הגדלה של עדשת המטרה) עם 2 X או 3 X זום.</li>
	<li>ליצור מספר מקטעים אופטי של כל תמונה שנבחרה (z-ערימות) כל 3 ערוצים (אדום, ירוק וכחול, RGB) באמצעות 0.35 שלב מיקרומטר. הערה: ההגדלה הסופי של הדגימה דמיינו ב- 10-20 X (הגדלה של עדשת המטרה) תהיה 63 X, בהתאמה, כאשר בשילוב עם 10 (בדרך כלל בשימוש) X העדשה הפנימית. דמיינו מחסנית אופטית דחוס כדי לאתר את האות 5mC ו- 5hmC</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מתילציה DNA hydroxymethylation דינמי והפיך DNA השינויים אשר modulatethe מגוון רחב של מנגנונים ביולוגיים מתפתחת גם כמו תאים postmitotic בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. כאן, אנו מתארים שיטה לשחזור לגילוי 5mC ו- 5hmC DNA השינויים בחיי עיר בטכניקת immunohistochemical (באמצעות נוגדנים anti-5mC ו- anti-5hmC) בסעיפים paraformaldehyde-קבוע קפוא של העכבר הרשתית, ולספק הנחיות ולשיפור המתקנות את התוצאות, במיוחד בעת השוואת מספר פרטים שונים. אנחנו קודם לכן השתמשו בשיטה זו על 5mC שינויים ברשתית עכבר עם הרשתית ספציפיים פילוח של Dnmt1, Dnmt3a , Dnmt3b DNA methyltransferase גנים, ודיווח דלדול (הצפויה) של סימני 5mC שלהם קרועות7 .
השלב הקריטי בזיהוי immunohistochemical 5mC הוא אופטימיזציה של טיפול סעיפים היסטולוגית עם HCl: פחות מ 15 דקות רעלני לא צפוי לייצר תוצאות לשחזור, ואילו טיפול מופרז עם HCl הורס את הגרעין ארכיטקטורה. מצאנו את התוצאה הטובה ביותר לאחר דגירה 30 דקות עם HCl. מומלץ תמיד להשתמש HCl טרי מדולל והפתרון PFA טרי 4% עבור קיבוע דנטורציה DNA רקמת רשתית.
כדי לפתור את התוצאות, אנו ממליצים לכלול שלושה או ארבעה ביולוגי משכפל תוך אופטימיזציה 5mC אות. בעוד כל אדם סט של נוגדן עשויה ליצור תוצאות שונות במקצת (אזורים heterochromatic בהיר יותר או פחות), אשר צפויה immunohistochemical בשיטה, 5mC, 5hmC הפצה גרעינית בתוך ערכת בודדים סעיפים צפוי להיות מאוד לשחזור, עבור כל עוד מופיע בפרוטוקול.
טכניקה זו יש גם הגבלה בעקביות הבחנו השתנות בחלוקה 5mC ב גרעינים תא קולט אור בתוך אותו סעיף. . מצאנו כמה גרעינים הראה אות חזק 5mC תוך גרעין התא הסמוך הראה שום אות 5mC... זאת בשל הגבלה ב גם ההומניסטית והאוטונומית אנטיגן 5mC על ידי טיפול HCl בסעיפים קפוא.
המשמעות של טכניקה זו מאפשרת 5mC לוקליזציה ללא טיפול K DNase ו proteinase מובילים יותר לשימור chromocenters. טכניקה זו הוא צפוי לעבוד robustly על כל קטעי כל רקמות בעלי חוליות, 5mC נשיאה, סימני 5hmC, מעובד עם גישה דומה, לא רק העכבר הרשתית, עבור כל עוד מופיע בפרוטוקול.

Epigenetic רגולציה של פיתוח, postmitotic הומאוסטזיס של רשתית העכבר הוא אזור מרתק של מחקר, אילו הבטחות להביא הבנה של מנגנונים ביולוגיים שליטה retinogenesis ותא גורל נחישות, תאים ייחודיים לסוג פונקציה מטבולית וכן תא פתולוגיות, מוות של תאים, התחדשות1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. כרומטין עובר שינויים דינמיים בשלבי פיתוח, כמו גם בתגובה אותות חיצוניים משתנה בין אם זה הלחץ, מטבולית או בתא המוות גירויים6,14,15, 16 , 17 , 18. ב העכבר גרעינים, כרומטין מחולק euchromatin פעיל והטרוכרומטין לא פעיל6,19,20. בגרעין לאטמוספרה, euchromatin שוכן באזור הפנימי של הגרעין ואילו הטרוכרומטין קווים את הפריפריה הגרעין ואת גרעינון. דפוס זה נקרא קונבנציונאלי והוא מאוד כולו ב פרוקריוטים. לעומת זאת, רוד גרעינים בעלי חיים ליליים כגון עכבר או חולדה יש הפוך דפוס שבו הגרעין מאוכלס על ידי הטרוכרומטין במרכז מוקף euchromatin ויוצרים את המעטפת החיצונית ביותר6,18, 20. בלידה, רוד גרעינים יש אדריכלות גרעיני קונבנציונלי. היפוך של רוד הגרעינים מתרחשת במהלך הפיתוח על ידי שיפוץ לאדריכלות גרעיני קונבנציונלי. במהלך תהליך זה, הטרוכרומטין היקפיים מפריד בין הפריפריה גרעינית, chromocenters להינתך יחד לצורה chromocenter יחיד במרכז של גרעין6,18.
מתילציה DNA גנומי משתתפת שליטה מקומיים כרומטין קונפורמציה21. מתילציה DNA מתרחשת במיקום 5' של ציטוזין שאריות של CpG dinucleotides כי הם מועשרים באזור המקדם של גנים רבים העכבר הגנום22,23,24,25,26 כמו גם intergenic ואזורים אינטרון, הנושאות אלמנטים תקינה27. מתילציה של CpG איים ב21,הפרוקסימלית היזמים24 וחלבונים CpG ג'ין משפרי27,28 חשוב בוויסות המצב הדינאמי של כרומטין טרינארית, המכיל רבים גורמים התפתחותיים גנים/תמלול משחקת תפקיד חשוב בתחום הפיתוח, סרטן להזדקנות29,30,31,32,33,34 . דנ א שלושה methyltransferases (DNMTs) להשתתף מתילציה DNA במהלך פיתוח העכבר35. כל שלושת DNMTs באים לידי ביטוי במהלך פיתוח רשתית העכבר36 , שינויים הספציפיים רשתית ב Dnmt גנים השפעת התפתחות הרשתית2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) הוא מוצר חמצוני של demethylation 5-methylcytosine (5mC). השלושה עשר-11 טרנסלוקציה (ט) אנזימים להשתתף3938,37,demethylation 5mC. Hydroxymethyl-C השינוי מועשר בתמציות היזמים, וגופי ג'ין intergenic רצף גנומית בתוך ג'ין עשיר, אזורים באופן פעיל משועתקים27,40.
יש מגוון של גישות שתואר בקביעת דפוסי מתילציה DNA שינוי של תאים41,42,43,44,45,46, חלקם הפעלת לכימות שינויים כלליים של מתילציה DNA בעוד שאחרים התמקדות מדויק שינויים באזורים עשירים CpG בתוך היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים. שיטות זיהוי, כימות של 5hmC היו גם דווח על47, לרבות על ידי אימונוהיסטוכימיה13. Immunohistochemical טכניקות, אשר מאפשרים ניטור חזקים של שינויים 5mC ו- 5hmC הגרעינים של פיתוח תאים postmitotic, הם מאוד אינפורמטיבי עבור בהתוויית כרומטין dynamics בחיי עיר בתגובה לשינויים חיצוני או פנימי להשפיע על48,4913,4,תאים. עם זאת, גישה זו היא נוטה ממעיט מתילציה DNA ושינויים hydroxymethylation עקב קשיים טכניים, הקשורים בזיהוי שינויים ציטוזין בהכנות היסטולוגית. זה בגלל ה-DNA פולרי בסיסים, כולל 5mC ו- 5hmC-השתנה ציטוזין, מוסתרים בתוך המרכז של סליל ה-DNA גדילי כפול50, וזקוקים חשיפת פרצופו האמיתי. . זה מאתגר במיוחד קפוא ההכנות היסטולוגית, אשר עלול לאבד במהירות ארגון מקיף של הרקמה המקורית כאשר היחס הקשה מוחל.
הרשתית העכבר הוא מודל מצוינת לנתח את התרומה של מתילציה DNA התפתחות עצבית, הומאוסטזיס postmitotic. יש רק 6 סוגים של נוירונים (photoreceptors רוד, קונוס, אמקרין, תאים דו-קוטביים, אופקי וגנגליון), תא גליה אחד (מולר עכשיו, דונלד) וסוג אחד neuroepithelial תא סוג (אפיתל הפיגמנט ברשתית)51. סוגי תאים ברשתית דווחו יש דפוסים ברורים של ה-DNA מתילציה18,19, אשר לאחרונה נחקרה על בסיס יחיד רזולוציה1,5,9,12. לאחרונה דיווחנו ליישום אימונוהיסטוכימיה בהתוויית 5mC דפוס של הפצה בתוך גרעין של תאים ברשתית ושינויים הגרעינים של רשתית העכבר למבוגרים, איפה כל שלושת ה-DNA methyltransferases הוסרו על ידי מיקוד מותנה 7. לעומת מספר דוחות, בו הנוכחות של מתילציה DNA של תאים ברשתית יכולה להיחשב רק חיובי או שלילי האות hypermethylated תאי העובר אפופטוזיס, הגישה שלנו זמין גילוי כרומטין ספציפי סידור בתוך האטומים התא רשתית, אשר אנו, מספר קבוצות דיווח קודם5,6,7,18,19,36 , 52. כאן, אנו מתארים את הטכניקה immunohistochemical (IHC) של גילוי 5mC ו- 5hmC בסעיפים קפוא paraformaldehyde-קבוע היסטולוגית הפרטים כמו גם להדגים את הנתונים, אשר היינו יכולים להתרבות מהדוח המקורי שלנו7 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29G1/2 ULTRA-FINE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissor</td>
			<td>Fine Science tools, Inc.&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>RPICORP.com</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslide Superfrost plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N HCl</td>
			<td>VWR analytical&#160;</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.3</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mC</td>
			<td>Genway Biotech&#160;</td>
			<td>GWB-BD5190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5hmC</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaminB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab16048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-225-1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-585-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRM HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>388114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

אפיגנטיקה של התפתחות הרשתית הוא שדה מחקר למד היטב, אשר מבטיח מביא רמה חדשה של הבנה לגבי המנגנונים של מגוון מחלות ניוון רשתית האדם והצבע גישות טיפול חדשות. הארכיטקטורה הגרעין של רשתית העכבר מאורגן שני דפוסים שונים: הפוך קונבנציונאלי. דפוס קונבנציונלי הוא אוניברסלי שבו הטרוכרומטין הוא מקומי לפריפריה של הגרעין, בעוד euchromatin פעיל שוכנת על הפנים גרעיני. לעומת זאת, הפוך דפוס גרעיני הוא ייחודי רוד למבוגרים קולט אור התא האטום שבו הטרוכרומטין. רגישה למרכז הגרעין, euchromatin מתגורר באזורי הפריפריה גרעינית. מתילציה DNA נצפית בעיקר ב- chromocenters. מתילציה DNA הוא שינוי דינמי קוולנטיות על משקעי ציטוזין (5-methylcytosine, 5mC) של CpG dinucleotides כי הם מועשרים באזורים המקדם של גנים רבים. שלושה methyltransferases DNA (DNMT1, DNMT3A ו- DNMT3B) להשתתף מתילציה של הדנ א במהלך הפיתוח. גילוי 5mC עם טכניקות immunohistochemical הוא מאוד מאתגר, תורם השתנות בתוצאות, כמו כל DNA בסיסים כולל בסיסים 5mC ששינה ומוסתרים בתוך סליל הדנ א גדילי כפול. אולם, תיחום מפורט של התפלגות 5mC במהלך הפיתוח היא מאוד אינפורמטיבי. כאן, אנו מתארים שיטה לשחזור לגילוי immunohistochemical חזקה של 5mC ושל עוד epigenetic DNA סמן 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), אשר colocalizes עם כרומטין 'פתח', transcriptionally פעיל בפיתוח, רשתית העכבר postmitotic.

כדי לקבוע את ההתפלגות של 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) במהלך התפתחות הרשתית, ברשתית postmitotic, אנו immunostained C57BL/6J העכבר ברשתית סעיף E16, P0, P15, P90 עם נוגדנים ספציפיים 5mC, 5hmC.
-E16 ההכתמה 5mC הייתה חזקה ב- chromocenters של גרעינים תא בזמן צביעת חלש נצפתה ב גרעינים התא כולו (איור 1 א'). ההכתמה 5hmC היה מרותק גרעינים תא והיה נעדר מן chromocenters (איור 1b).
ברשתית P0, האות 5mC מקומי את chromocenters של גרעין התא, הגרעין לפריפריה (איור 2a, החצים, חץ). גם הבחנו מכתים חלש של 5mC בין chromocenters של גרעינים התא. האות 5hmC היה מאוד נוכח גרעינים תא חוץ chromocenters (איור 2b). . מצאנו שעוד גרעינים מוכתמים 5mC ו- 5hmC בשכבה הפנימית neuroblast (INBL) (c איור 2, קו מנוקד)
ברשתית P15, מצאנו מכתים חזק של 5mC ושל 5hmC השכבה החיצונית גרעינית (גרת), השכבה הפנימית גרעינית (להיכנס), שכבת תאים גנגליון (שזכתה) (איור 3). גרת (רוד photoreceptors), האות 5mC היה נוכח chromocenters של גרעין התא, הגרעין לפריפריה (דמויות 3a-3 c, 3 g). האות 5hmC נמצאה גרעינים התא כולו למעט chromocenters (דמויות 3d-3f). במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים על הרשתית P15 מציגה את התפלגות של תחומים heterochromatic רוד תא גרעינים דומה לזה נמצא עם האות נוגדן 5mC (דמויות 3 h ו- 3עכשיו).
ההכתמה 5mC להיכנס, שזכתה היה. חזק chromocenters של גרעינים תא, צביעת חלש נצפתה גם בתוך גרעין התא כולו (דמויות 3j-3 l ו- 3r-3t). בניגוד 5mC, האות 5hmC מקומי גרעינים התא כולו למעט chromocenters להיכנס, שזכתה (דמויות 3 מ'-3o ו 3 בגודל 3u-ואט). הבחנו חזקה 5hmC אות על הפריפריה של גרעין התא שזכתה.
ב- photoreceptors רוד למבוגרים, האות 5mC היה מוגבל chromocenter ואת הגרעין לפריפריה של גרעינים תא (דמויות 4a-4 c), ואילו 5hmc האות היה מרותק הפריפריה גרעינית (4 דמויות d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> איור 1. לוקליזציה של 5-methylcytosine ו- 5-hydroxymethylcytosine ברשתית העכבר מתחלקים היום 16. Immunostaining של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים 5mC (אדום, a) ו- 5hmC (ירוק, b). -E16, 5mC אות היא מאוד חזקה ב- chromocenters של גרעינים תא גם נוכח גרעינים התא כולו ברמה נמוכה יותר. 5hmC מכתים היה באופן בלעדי מוגבלת את גרעין התא. לוח c מייצג 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול, ג). כניסות מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית של תמונות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> באיור 2. נוגדן של 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine ברשתית העכבר ביום כמחנכת 0. Immunolabeling של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים 5mC (אדום, a) ו- 5hmC (ירוק, b). ברשתית P0, 5mC ו 5hmC נוכחים השכבה החיצונית neuroblast (ONBL) והן השכבה הפנימית neuroblast (INBL). a) האות 5mC קיים בחריפות chromocenters (חץ) ואת הגרעין לפריפריה של גרעינים תא (חץ). צביעת חלש של 5mC הוא ציין גם בין chromocenters של גרעין התא. b) 5hmC מכתים מוחזק בתוך גרעין התא, אות חזק נצפית ב- INBL (קו מנוקד לוח ג'). לוח c מייצג 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול, ג). כניסות מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית של תמונות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> איור 3. 5-methylcytosine 5-hydroxymethylcytosine והפצה ברשתית העכבר ב 15 יום לאחר הלידה. Immunostaining של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים anti-5mC ו- 5hmC (-g, j-y). בשכבה החיצונית גרעינית (גרת) (רוד photoreceptors), האות 5mC (א) בדרך כלל עולה בקנה אחד עם chromocenters של גרעינים תא (ראש חץ, b), אדום, רגישה גם לפריפריה גרעינית (חץ, b). פאנל b (אדום) ו- c (אפור) מייצג את ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה. האות 5hmC (ירוק, d) מוגבל גרעינים התא כולו למעט chromocenters. לוח אלקטרוני (ירוק), f (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית קולטים תמונת לוח g מייצגת 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי. לוח h ואני הם שידור תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים של גרעינים קולט אור-כמחנכת היום 15 בסה כ מציג בחתך תחומים heterochromatic. ראש חץ שחור ב- h לוח מצביע על מוט יחיד קולט אור גרעין בלוח ט ראשי חץ אדום בחלונית שלב לתחומים heterochromatic בתוך מוט קולט אור גרעין בעוד חצים אדומים להצביע הטרוכרומטין בפריפריה גרעינית. להיכנס (j-q), שזכתה תא גרעינים (r-y), האות 5mC (אדום) הוא מקומי כדי chromocenters ההווה בפריפריה, צביעת חלש הוא זוהה גם בשאר חלקי האטום התא. לוח k (אדום) ואני (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתקופה של התמונה. 5hmC ההכתמה (ירוק) בתוך גרעין התא להיכנס, שזכתה מוגבל גרעין התא כולו. שימו לב חזק 5hmC מכתים בפריפריה גרעיני תאי שזכתה. לוח p ו- x מייצגים 5mC הממוזג, 5hmC התמונה בעוד לוח q ו- y מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית תמונה p, x בהתאמה. הגרעינים הם counterstained עם דאפי. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> באיור 4. 5-methylcytosine 5-hydroxymethylcytosine והפצה של רוד קולט אור גרעינים של רשתית העכבר C57BL/6J ביום כמחנכת 90. ההכתמה 5mC (אדום,) בחריפות נוכח chromocenter של גרעין התא, גם המתנה חלש באזורי הפריפריה גרעינית. פאנל b (אדום) ו- c (אפור) מייצג את ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה. 5hmC ההכתמה (ירוק, d) באופן בלעדי מוגבל על e לוח הגרעין לפריפריה (ירוק), f (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית קולטים תמונת לוח g מייצג 5mC הממוזגים 5hmC תמונה תוך לוח h הוא הגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה שג גרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina at JoVE.com

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

מטרת הדו ח היא לתאר את הפרוטוקול לגילוי immunohistochemical חזקה של סמני epigenetic, 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בפיתוח, postmitotic העכבר הרשתית.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

This method can help answer key questions in the DNA methylation field, such as changes in chromatin during retinal development in postmitotic retina. The main advantage of this technique is that it can be used robustly on any sections from all mouse retina tissues carrying 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine distribution that are processed in a similar approach. Visual demonstration of this method is critical as the tissue preparing and staining steps are difficult to learn, because if frozen histological preps are being used, valuable organizational and original tissue can be lost.Demonstrating the rest of the procedure will be Pablo Diaz, research associate from our laboratory. To start this procedure, use a 29 gauge one half inch needle to puncture the eyes of a decapitated euthanized mouse on the dorsal side of the eyes. To obtain eye cups, immediately enucleate the eyes by cutting around the sclera with fine ophthalmic scissors to remove the cornea and the lens.Fix the eye cups and E16 whole eyes in 4%paraformaldehyde or PFA in 1xPBS pH 8.0 for 20 minutes at room temperature. Wash them twice in one milliliter of 1xPBS at room temperature for 10 minutes. To cryoprotect the eye cups and whole eyes, incubate them in 1xPBS pH 8.0 with 10%sucrose at room temperature for one hour.Then in 20%sucrose in 1xPBS for one hour. And finally in 30%sucrose in 1xPBS at 4 degrees Celsius overnight. On the following day, embed the eye cups and eyes in optimal cutting temperature compound, or OCT, in cryomolds.Then snap freeze them in a dry ice ethanol bath and keep at 80 degrees Celsius. Prior to starting cryosectioning, remove the molds with embedded eye cups and eyes from 80 degrees Celsius. Place them in a cryostat holder and allow them to equilibrate to 20 degrees Celsius for one hour.Using a cryostat at 20 degrees Celsius, cut 12 micrometer thick retinal cross sections parallel to the temporonasal axis through the optic nerve head. Mount the sections on microscope slides and store at 80 degrees Celsius. To start immunostaining, use a hydrophobic barrier pen to encircle the retinal sections mounted on slides.Wash the sections once with 200 microliters of 1xPBS for 10 minutes. Permeabilize the sections with 200 microliters of PBST for 10 minutes at room temperature. Then denature them with 200 microliters of freshly made carefully titrated 2 Normal hydrochloric acid in 1xPBS for 45 minutes at 37 degrees Celsius to optimize 5mC signal.After denaturation, add 100 microliters of 0.1 Tris-HCl pH 8.3 on the retinal sections, and incubate for 10 minutes at room temperature to neutralize them. Then, add 500 microliters of blocking solution. And incubate the sections in a humidity chamber at room temperature for one hour.Add the appropriate antibodies, diluted one to 500 in blocking solution, to the sections and incubate overnight at four degrees Celsius. On the following day, wash the sections three times for 10 to 15 minutes each with 0.1%PBST. Add appropriate secondary antibodies diluted one to 1000 in blocking solution containing DAPI solution at room temperature for one hour.Next, wash the slides three times with one milliliter of 0.1%PBST for 10 minutes each. After the last wash, add aqueous mounting medium. Cover with a coverslip.And then proceed with confocal microscopy. After retinal immunostaining at E16, 5mC signal was strong in chromocenters of the cell nuclei and present at a much lower level in the whole cell nuclei. 5hmC staining was exclusively found in the cell nuclei and absent from the chromocenters.In P0 retina, both 5mC and 5hmC signals were present in the outer neuroblast layer, and inner neuroblast layer. 5mC signal was strong in the chromocenters and nuclear periphery of the cell nuclei, and weaker in between the chromocenters of cell nuclei. 5hmC staining was restricted to the cell nucleus.In P15 retina, in the outer nuclear layer, 5mC signal was detected in the chromocenters of the cell nuclei and nuclear periphery. Whereas 5hmC signal was in the whole cell nuclei except for the chromocenters. In the inner nuclear, and ganglion cell layer, 5mC signal was strong in the chromocenters of the cell nuclei, and weak in whole cell nuclei.Whereas the 5hmC signal was found in the whole cell nuclei except for the chromocenters. In adult rod photoreceptors, the 5mC signal was limited to the chromocenter and nuclear periphery, whereas 5hmC signal was restricted to the nuclear periphery. While attempting this procedure, it's important to remember to treat histological sections with the optimal exposure of HCl, which is 30 minutes.If the exposure is less or more, then optimal results can not be reproducible. Following this procedure, other methods, like high pressure liquid chromatography, mass spectrometry can be performed in order to answer additional questions like quantification of changes in measuring 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of neural development to explore epigenetic changes in chromatin.Don't forget that working with HCl and PFA can be extremely hazardous, and precautions, such as proper disposal, should always be taken while performing this procedure.