이 작품은 지원 SBIR 교부 금 (1R44EY027654-01A1)에 의해.

아동 병원 오클랜드 연구소 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 및 사용에 대 한 비전과 안과 (ARVO) 문에서 연구 협회 준수 프로토콜에 따라 마우스와 모든 절차 수행 했다 안과에서 동물의 연구 비전 및.
1. 조직 준비 Immunostaining
<ol><li>C57 BL/6J 생쥐 배아 하루 (E) 16, 산 후 (P)에서 안락사 0, P15와 p90 받게 이산화탄소 (CO2) 잘린 (E16와 P0 쥐)에 의해 다음에 의해.</li>
	<li>즉시 enucleate 마우스 눈 29G 1/2는 눈의 등 쪽에 바늘으로 구멍. 인산 염 버퍼 식 염 수 (1 x PBS) ph 8.0 실 온에서 5 분 (최소) 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL에 품 어.</li>
	<li>눈 컵 P0, P15, p90 받게, 각 막을 밖으로 해 부와 눈이 4%에 있는 동안 좋은 안과 위 렌즈 PFA. 참고: 건너뛰기 E16 눈은 눈으로이 단계는 너무 작은.</li>
	<li>수정 눈 컵 (P0, P15와 p90 받게)와 전체 눈 (E16) 4 %PFA에서 실 온에서 20 분. 다음 실 온에서 10 분의 1 x PBS의 1 mL에 두 번 눈 컵 및 전체 눈을 씻어.</li>
	<li>Cryoprotect 눈 컵 그리고 1xPBS, pH 8.0 포함 10% 자당 1 시간 동안에 전체 눈. 1 시간 동안 20% 자당 1 x PBS에 유지 하 고 4 ° c.에 하룻밤 1 x PBS에서 30% 자당 포화</li>
	<li>다음 날, 최적의 절삭 온도 화합물에 (10 월), (500 µ L) cryomolds에서 눈 컵 및 전체 눈을 포함, 스냅-동결 드라이 아이스/에탄올 목욕에서과-80 ° c.에 저장</li>
	<li>-80 ° C에서 임베디드 눈 컵 및 전체 눈 금형 제거과 cryosectioning 전에 1 시간 동안-20 ° C에 equilibrate 수 있습니다.</li>
	<li>잘라 망막 횡단면 (12 µ m 두께) 축에 평행 temporonasal-20 ° c.에 있는 cryostat를 사용 하 여 시 신경 머리를 통해</li>
	<li>현미경 슬라이드53 -80 ° c.에가 게에 망막 섹션을 탑재</li>
</ol>2. Immunostaining 5-엠씨 및 5-hmC 항 체와
<ol><li>소수 성 장벽 펜으로 슬라이드에 장착 된 망막 섹션을 둘러싸십시오 소수 성 장벽을 펜 얼룩 조직 하는 데 필요한 항 체의 볼륨을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>10 분의 1 x PBS의 200 µ L 한번 망막 섹션을 씻어.</li>
	<li>0.1%의 200 µ L로 망막 섹션 permeabilize 실 온에서 10 분의 1 x PBS (PBS-T)에 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>변성 망막 섹션의 200 µ L 30 분 동안 37 ° C 배양 기에서 1 x PBS에 갓 2 N (HCl) 염 산을 만든. 참고: HCl 치료의 주의 적정 5mC 신호를 최적화 하기 위해 필요 합니다.</li>
	<li>항상 5mC 신호54를 최적화 하는 동안 생물 복제 (3-4)를 포함 합니다. 참고: 우리가 4 시간 포인트 (15 분, 30 분, 1 시간 및 2 시간)에서 항 원 검색 그리고 발견된 30 분 인큐베이션 5mC 신호에 대 한 최적입니다. HCl 가진 더 긴 외피 5mC 신호는 핵을 지역화 하는 무 능력으로 이어지는 핵의 구조 저하 됩니다.</li>
	<li>변성, 후 중화 망막 섹션 0.1의 100 µ L을 추가 하 여 10 분 동안 망막 부분에 트리 스-HCl (pH 8.3) M.</li>
	<li>차단 하는 솔루션의 500 µ L에 섹션을 품 어 (0.1%에서 5 %preimmune 정상 염소 혈 청 1 x PBS에 Triton X-100) 습도 챔버에 실 온에서 1 h.</li>
	<li>차단, 추가 안티-5mC; 안티-5hmC 항 체 희석 망막 섹션에 솔루션을 차단에 1: 500.</li>
	<li>망막 섹션 습도 챔버에 4 ° C에서 하룻밤을 품 어.</li>
	<li>다음 날 세척, 망막 섹션 3 0.1% (10-15 분 각 시간) 시간 PBS-T 다음 해당 보조 항 체와 함께 솔루션을 차단에 품 어 고 (염소 안티 토끼와 염소 반대로 마우스 IgG, 희석; 1:1000), DAPI (4', 6-를 포함 하 diamidino-2-phenylindole) 솔루션 (1 µ g/mL) 솔루션을 차단에 1 시간을 위한 실내 온도에. 참고: 섹션의 immunodetection의 모든 단계 동안 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>씻어 슬라이드 1 mL의 0.1%와 3 시간 PBS.</li>
	<li>마지막 세척 후 수성 장착 매체는 coverslip 아래 섹션을 탑재 하 고 무색 매니큐어와 함께 인감.</li>
</ol>3. confocal Immunohistochemistry
<ol><li>항상 한 가지 방법 (예를 들어, 최대), 일관성에 대 한 직면 시 컵의 망막 색소 상피 면을 섹션을 방향을 정하십시오.</li>
	<li>Immunostained 망막 섹션 63 X에서 (대물 렌즈의 배율) 2 X의 이미지 캡처를 수행 또는 3 배 줌.</li>
	<li>각 선택 된 이미지의 여러 광학 섹션 생성 (z-스택) 모든 3 채널 (빨강, 녹색 및 파랑 RGB)에 0.35 µ m 단계를 사용 하 여. 참고: 견본 10-20 X에서 시각의 최종 배율 (대물 렌즈의 배율) 될 것입니다 63 X, 각각, (일반적으로 사용 되는) 10 배 눈 렌즈와 함께. 5mC와 5hmC 신호를 찾으려고 압축된 광학 스택을 시각화합니다</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

DNA 메 틸 화와 hydroxymethylation는 역동적이 고 가역 DNA 수정, modulatethe는 개발 뿐만 아니라 postmitotic 세포에서 생물 학적 메커니즘의 다양 한 범위. 여기, 우리가 설명 하는 단원의 paraformaldehyde 고정 냉동 마우스 망막의 immunohistochemical 기술 (안티-5mC와 안티-5hmC 항 체를 사용 하 여)에 의해 5mC와 5hmC DNA 수정에서 제자리에서 탐지 하기 위한 재현 기법 제공 개선 하 고 여러 다른 견본을 비교 하는 경우에 특히, 결과 표준화 지침. 우리 이전 5mC 변경 Dnmt1, Dnmt3a 및 Dnmt3b DNA methyltransferase 유전자를 망막 특정 프로세서용으로 마우스 망막에 윤곽을 그리 다이 메서드를 사용 하 고 보고 그들의 망막7에에서 5mC 마크 (예상된) 고갈 .
5mC immunohistochemical 감지에 중요 한 단계는 HCl 조직학 섹션의 처리의 최적화: HCl와 과도 한 치료는 핵을 파괴 하는 반면 15 분 전처리 재현성 결과 생산 하지 예상 보다 적은 아키텍처입니다. 우리는 HCl과 30 분 부 화 후 최상의 결과 발견. 우리는 항상 DNA 변성 및 망막 조직 고정을 위한 갓 희석된 HCl와 갓 만든된 4 %PFA 솔루션을 사용 하는 것이 좋습니다.
결과 해결 하려면 5mC 신호를 최적화 하는 동안 3 ~ 4 생물 복제를 포함 하도록 권장 합니다. 각각의 설정 하는 동안 immunohistochemical 얼룩 생성할 수 있습니다 약간 다른 결과 (다소 밝은 heterochromatic 지구를), 개별 집합 내의 immunohistochemical 방법, 5mC 및 5hmC 핵 분포에 예상 되는 섹션의 프로토콜 다음으로 재현성에 대 한 것으로 예상 된다.
이 기술은 또한 있다 제한 우리가 일관 되 게 동일한 섹션 포토 리셉터 세포 핵에 5mC 유통에서 변화 관찰. 우리는 인접 한 세포 핵 보였다 5mC 신호 하는 동안 강한 5mC 신호를 보여 일부 핵을 발견. 이것은 냉동된 섹션에서 HCl 처리에 의해 unmasking 5mC 항 한계 때문 이다.
이 기술의 중요성 DNase 및 가수분해 K 치료 chromocenters의 더 나은 보존을 선도 하지 않고 5mC 지역화를 수 있습니다. 이 기술은 모든 척추 동물의 조직, 운반 5mC, 5hmC 마크에서 어떤 섹션에 견고 하 게 작동 하는 것으로 예상 하 고 프로토콜 다음으로 뿐만 아니라 마우스 망막, 비슷한 방식으로 처리.

개발의 후 성적인 규정 및 마우스 망막의 postmitotic 항상성 retinogenesis 및 세포 운명 결정 제어 생물 학적 메커니즘에 대 한 새로운 이해를가지고 어떤 약속 셀 형식 관련 연구의 흥미로운 영역입니다. 신진 대사 기능, 세포 병 리, 세포 죽음 및 중생1,2,3,,45,6,,78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 스트레스, 대사 또는 세포 죽음 자극6,,1415, chromatin 가변 외부 신호에 대 한 응답에서 뿐만 아니라 개발, 동적 변화를 겪 습 16 , 17 , 18. 마우스 핵 chromatin 활성 euchromatin 및 비활성 섬으로6,,1920으로 분할 된다. Interphase 핵에 euchromatin 섬으로 라인 핵 주변 및 핵소체 반면 핵의 내부 영역에 상주 합니다. 이 패턴은 기존의 불리고 진핵생물에서 고도로 보존. 반면, 마우스와 쥐 같은 야행성 동물에 막대 핵 핵 섬으로 둘러싸인 euchromatin 바깥쪽 껍질6,18, 형성 하는 센터에 의해 점유 된다 패턴 거꾸로 있다 20. 출생 시, 로드 핵 기존의 핵 건축이 있다. 막대 핵의 반전 기존의 핵 건축 리 모델링 하 여 개발 하는 동안 발생 합니다. 이 과정 동안, 주변 섬으로 핵 주변에서 분리 하 고 chromocenters 융합 센터에서 단일 chromocenter 형태의 핵6,18.
게놈 DNA 메 틸 화 제어 로컬 chromatin 구조21에 참여 합니다. DNA 메 틸 화는 5' 풍성 하 게 CpG 디의 시 토 신 잔류물의 마우스 게놈22,23,,2425,26 에 많은 유전자의 발기인 지구에 있는 위치에서 발생 뿐만 아니라 intergenic intron 지역, 규제 요소27을 수행. 근 위 발기인21,24 에 CpG 섬 및 유전자 증강27,28 CpG 시퀀스의 메 틸 화는 포함 하는 많은 chromatin의 동적 상태를 조절에 중요 한 발달 유전자/녹음 방송 요인 개발, 암 및 노화29,30,31,32,,3334 에서 중요 한 역 . 3 DNA methyltransferases (DNMTs) 마우스 개발35동안 DNA 메 틸 화에 참여합니다. 모든 3 개의 DNMTs 마우스 망막 개발36 과 Dnmt 유전자 영향 망막 개발2,7망막 특정 변화 하는 동안 표시 됩니다. Hydroxymethylcytosine (5hmC) 5-methylcytosine (5mC) demethylation의 산화 제품 이다. 3 10-11 전 (TET) 효소 5mC demethylation37,,3839에 참여. Hydroxymethyl C 수정 발기인, 유전자 몸과 유전자 부자와 적극적으로 베낀된 지역27,40intergenic 게놈 시퀀스에 농축입니다.
다양 한 방식의 설명 셀41,,4243,44,45,46에서 DNA 메 틸 화 패턴 변화를 결정 하는 데, 그들 중 일부는 사용 DNA 메 틸 화 CpG 풍부한 지역 발기인과 증강에에서 정확한 변화에 초점을 맞추고 다른 사람들의 세계적인 변화 측정 검색 및 5hmC의 정량화 방법 또한 보고 된47, immunohistochemistry13포함 했다. 5mC와 5hmC 변화에 핵 개발의 강력한 모니터링 활성화 Immunohistochemical 기법, postmitotic 세포, chromatin 역학에서 제자리에서 외부 또는 내부 변화에 대응 묘사에 대 한 매우 유익 하지 않습니다 셀4,13,,4849에 영향을. 그러나,이 접근은 DNA 메 틸 화 및 조직학 준비에서 시 토 신 수정 감지와 관련 된 기술적인 어려움 때문에 hydroxymethylation 변화를 과소 평가 하는 경향이 있다. 이 때문에 비 극성 DNA 기초, 5mC 5hmC 수정 시 토 신 등은 이중 가닥 DNA 나선50의 센터에서 숨겨지고 unmasking 필요. 이것은 가혹한 치료 적용 되 면 원래 조직의 유익한 조직을 잃을 수 있습니다 급속 하 게 냉동된 조직학 준비에서 특히 도전적 이다.
마우스 망막 신경 개발 및 postmitotic 항상성 DNA 메 틸 화에의 기여를 해 부하는 우수한 모델입니다. 뉴런의 6 종류만 있다 (막대와 콘 대뇌, amacrine, 바이 폴라, 수평 및 신경 절 세포), glial 세포 유형 (뮬러 명과) 및 한 neuroepithelial 세포 유형 (망막 안료 상피)51. 망막 세포 유형 DNA 메 틸 화18,19, 최근 단일 기본 해상도1,,59,12공부는의 명백한 본을 보고 했다. 우리는 최근 immunohistochemistry 응용 프로그램 묘사 5mC 성인 마우스 망막, 조건부 타겟팅 하 여 제거 된 모든 3 개의 DNA methyltransferases의 핵의 망막 세포 핵 내에서 분포의 패턴을 보고 7. 보고서, 망막 세포에서 DNA 메 틸 화의 존재는 긍정적 으로만 볼 수 또는 hypermethylated에서 부정적인 신호 겪고 apoptosis 세포의 수에 비해 우리의 접근 활성화 감지 특정 chromatin 우리 여러 그룹 보고 하 고 앞에서 설명한 망막 세포 핵 내 배열5,6,7,,1819,36 , 52. 여기, 우리 뿐만 아니라 우리의 원래 보고서7에서에서 재현 수 있었습니다 데이터 설명 단원의 냉동 paraformaldehyde 고정 조직학 세부 사항에 5mC 및 5hmC를 감지 immunohistochemical (IHC) 기술을 설명 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29G1/2 ULTRA-FINE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissor</td>
			<td>Fine Science tools, Inc.&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>RPICORP.com</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslide Superfrost plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N HCl</td>
			<td>VWR analytical&#160;</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.3</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mC</td>
			<td>Genway Biotech&#160;</td>
			<td>GWB-BD5190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5hmC</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaminB1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab16048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-225-1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-585-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRM HM 550</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>388114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in developing and postmitotic mouse retina

Epigenetics 망막 개발의 다양 한 인간의 망막 퇴행 성 질병의 메커니즘에 대 한 이해의 새로운 수준을 약속 새로운 치료 접근을 정확 하 게 잘 공부 연구 분야 이다. 마우스 망막의 핵 아키텍처는 두 개의 서로 다른 패턴 구성: 전통과 반전. 기존의 패턴은 동안 활성 euchromatin 핵 내부에 있는 섬으로, 핵의 주변에 지역화는 보편적 이다.입니다. 반면, 거꾸로 핵 패턴은 섬으로 localizes 핵 센터 및 euchromatin 핵 주변에 있는 성인 봉 포토 리셉터 세포 핵에 고유 합니다. DNA 메 틸 화는 chromocenters에서 주로 관찰 된다. DNA 메 틸 화 CpG 디 많은 유전자의 발기인 지구에 풍성 하 게 하는 시 토 신 잔류물 (5-methylcytosine, 5mC)에 동적 공유 수정입니다. 3 DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A와 DNMT3B) 개발 중 DNA의 메 틸 화에 참여합니다. Immunohistochemical 기술로 검출 5mC은 매우 도전, 결과, 다양성에 기여 하는 5mC 수정 기지를 포함 하 여 모든 DNA 기초는 이중 가닥 DNA 나선 안에 숨겨져 있습니다. 그러나, 개발 하는 동안 5mC 배포의 상세한 묘사 매우 유익 하지 않습니다. 여기, 우리 5mC와 다른 후 성적인 DNA 마커 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) 개발에 "오픈", transcriptionally 활성화 chromatin와 colocalizes는 강력한 immunohistochemical 감지에 대 한 재현 기법을 설명 하 고 postmitotic 마우스의 망막

Postmitotic 망막 및 망막 개발 하는 동안 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)의 분포를 결정 하기 위해 우리 immunostained C57BL/6J 마우스 망막 섹션 E16, P0, P15, p90 받게에서 특정 항 체와 5mC와 5hmC.
E16 5mC 얼룩 했다 세포 핵의 chromocenters에서 강한 동안 전체 세포 핵 (그림 1a)에서 관찰 되었다 약한 얼룩. 세포 핵에 국한 되었다 5hmC 얼룩이 지 고 결 석 했다 chromocenters (그림 1b)에서.
P0 망막 5mC 신호 세포 핵과 핵 주변 (그림 2a, 화살표 및 화살표)의 chromocenters에 지역화 되었습니다. 우리는 또한 세포 핵의 chromocenters 사이 5mC의 약한 얼룩이 관찰. 5hmC 신호 chromocenters (그림 2b) 제외한 세포 핵에 강력 하 게 존재 했다. 우리는 더 많은 핵 5mC와 5hmC 내부 neuroblast 레이어 (INBL) (그림 2 c, 점선)에 묻은 게 있다 발견
P15 망막에서 우리는 5mC와 외부 핵 층 (ONL), 안 핵 층 (INL)와 신경 절 세포 층 (GCL) (그림 3)에서 5hmC의 강한 얼룩 다는 것을 발견. ONL (로드 대뇌), 5mC 신호 세포 핵과 핵 주변 (그림 3a-3 c, 3 세대)의 chromocenters에 존재 했다. 5hmC 신호는 chromocenters (그림 3-3 층)를 제외한 전체 세포 핵에 발견 되었다. P15 망막에 전송 전자 현미경 검사 법 5mC 항 체 신호 (그림 3 h 와 3i) 발견 비슷한 막대 세포 핵에 heterochromatic 도메인의 분포를 보여줍니다.
INL 및 GCL 5mC 얼룩 세포 핵의 chromocenters에 강한 고 약한 얼룩 전체 세포 핵 (수치 3j-3 l 과 3t 3r)에서 또한 관찰 되었다. 5mC, 반면 5hmC 신호 했다 INL 및 GCL (그림 3 m-3o 및 3u 3w)에서 chromocenters 제외한 전체 세포 핵에 지역화 됩니다. 우리는 강한 관찰 GCL 세포 핵의 주변에서 5hmC 신호.
성인 봉 대뇌에서 5mC 신호 5hmc 신호는 핵 주변 (그림 4 d-4 층)에 국한 되었다 하는 동안 chromocenter 및 세포 핵 (그림 4a-4 c)의 핵 주변에 제한 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> 그림 1입니다. 지 배아 일 16에 방화 5-methylcytosine 및 마우스 망막에 5-hydroxymethylcytosine 5mC에 항 체와 C57BL/6J 망막의 Immunostaining (빨강) 및 5hmC (녹색, b). E16, 5mC 신호 세포 핵의 chromocenters에 매우 강하고 또한 훨씬 낮은 수준에서 전체 세포 핵에 존재입니다. 5hmC 얼룩 세포 핵에 독점적으로 수감 했다. 패널 c 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI (블루, c)와 counterstained는. 음각은 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> 그림 2입니다. Immunohistochemical 출생 후 하루 0에서 5-methylcytosine 및 마우스 망막에 5-hydroxymethylcytosine의 얼룩. 5mC에 항 체와 C57BL/6J 망막의 Immunolabeling (빨강) 및 5hmC (녹색, b). P0 망막 5mC와 5hmC에서는 외부 neuroblast 레이어 (ONBL)와 내부 neuroblast 레이어 (INBL)에 있습니다. 5mC) 신호는 chromocenters (화살표)과 셀 핵 (화살촉)의 핵 주변에 강력 하 게 존재. 5mC의 약한 얼룩 세포 핵의 chromocenters 사이 관찰 됩니다. b) 5hmC 얼룩은 세포 핵에 국한 하 고 강한 신호는 INBL (패널 c에서 점선)에서 관찰 됩니다. 패널 c 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI (블루, c)와 counterstained는. 음각은 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> 그림 3입니다. 5-methylcytosine 및 5-hydroxymethylcytosine 배포 마우스 망막에서 출생 후 하루 15에서. 안티-5mC와 5hmC 항 체 (a-g, j-y)와 함께 C57BL/6J 망막의 Immunostaining. 외부 핵 층 (ONL) (막대 대뇌) 5mC 신호에에서 (빨강, 셀 핵 (화살촉, b)의 chromocenters와 일치 한) 일반적으로 고도 (화살표, b) 핵 주변에 localizes. 패널 (빨간색)와 c (회색) 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 한. 5hmC 신호 (녹색, d)는 chromocenters 제외 하 고 전체 셀 핵에 국한 됩니다. 패널 (녹색)와 f (회색) g 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타내는 이미지 디 패널에서에서 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 counterstained는. 패널 h와 나는 heterochromatic 도메인의 산 후 하루 15 보여주는 배포에서 포토 리셉터 핵의 전송 전자 현미경 이미지입니다. 패널 h에 검은 화살표 빨간색 화살표 핵 주변에 있는 섬으로 가리킨 동안 로드 포토 리셉터 핵 내의 heterochromatic 도메인을 가리킨 패널에 빨간 화살촉 단일 로드 포토 리셉터 핵 패널 i. 확대를 가리킵니다. INL (j-q), GCL 세포 핵 (r-y) 5mC 신호 (적색) 주변에 chromocenters를 지역화 하 고 약한 얼룩 감지 세포 핵의 나머지에서. 패널 k 씨 (빨간색)와 (회색) 이미지 j에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 나타냅니다. 5hmC 얼룩 (녹색) INL 및 GCL 세포 핵에 전체 세포 핵에 국한 됩니다. Note 강한 5hmC GCL 셀의 핵 주변에 얼룩. 패널 p와 x 패널 q 및 y 각각 이미지 p와 x에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 하는 동안 병합된 5mC와 5hmC 이미지를 나타냅니다. 핵은 DAPI와 counterstained는. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> 그림 4입니다. 5-methylcytosine 및 5-hydroxymethylcytosine 배포 로드 포토 리셉터 핵에 C57BL/6J 마우스 망막의 산 후 하루 90에서. 5mC 얼룩 (빨강, 한) 핵 주변에 있는 세포 핵 및 또한 약하게 현재 chromocenter에 강력 하 게 존재 하는. 패널 (빨간색)와 c (회색) 이미지에 별표와 함께 표시 하는 영역의 확대를 대표 한. 5hmC 얼룩 (녹색, d)은 독점적으로 핵 주변 패널 e (녹색)에 국한 하 고 g 병합된 5mC와 패널 h 동안 5hmC 이미지를 나타내는 이미지 디 패널에서에서 별표와 함께 표시 된 영역의 f (회색) 대표 확대 표시 영역의 확대 g. 핵 DAPI (파란색)와 counterstained는 이미지에 별표. 눈금 막대: 5 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

This method can help answer key questions in the DNA methylation field, such as changes in chromatin during retinal development in postmitotic retina. The main advantage of this technique is that it can be used robustly on any sections from all mouse retina tissues carrying 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine distribution that are processed in a similar approach. Visual demonstration of this method is critical as the tissue preparing and staining steps are difficult to learn, because if frozen histological preps are being used, valuable organizational and original tissue can be lost.Demonstrating the rest of the procedure will be Pablo Diaz, research associate from our laboratory. To start this procedure, use a 29 gauge one half inch needle to puncture the eyes of a decapitated euthanized mouse on the dorsal side of the eyes. To obtain eye cups, immediately enucleate the eyes by cutting around the sclera with fine ophthalmic scissors to remove the cornea and the lens.Fix the eye cups and E16 whole eyes in 4%paraformaldehyde or PFA in 1xPBS pH 8.0 for 20 minutes at room temperature. Wash them twice in one milliliter of 1xPBS at room temperature for 10 minutes. To cryoprotect the eye cups and whole eyes, incubate them in 1xPBS pH 8.0 with 10%sucrose at room temperature for one hour.Then in 20%sucrose in 1xPBS for one hour. And finally in 30%sucrose in 1xPBS at 4 degrees Celsius overnight. On the following day, embed the eye cups and eyes in optimal cutting temperature compound, or OCT, in cryomolds.Then snap freeze them in a dry ice ethanol bath and keep at 80 degrees Celsius. Prior to starting cryosectioning, remove the molds with embedded eye cups and eyes from 80 degrees Celsius. Place them in a cryostat holder and allow them to equilibrate to 20 degrees Celsius for one hour.Using a cryostat at 20 degrees Celsius, cut 12 micrometer thick retinal cross sections parallel to the temporonasal axis through the optic nerve head. Mount the sections on microscope slides and store at 80 degrees Celsius. To start immunostaining, use a hydrophobic barrier pen to encircle the retinal sections mounted on slides.Wash the sections once with 200 microliters of 1xPBS for 10 minutes. Permeabilize the sections with 200 microliters of PBST for 10 minutes at room temperature. Then denature them with 200 microliters of freshly made carefully titrated 2 Normal hydrochloric acid in 1xPBS for 45 minutes at 37 degrees Celsius to optimize 5mC signal.After denaturation, add 100 microliters of 0.1 Tris-HCl pH 8.3 on the retinal sections, and incubate for 10 minutes at room temperature to neutralize them. Then, add 500 microliters of blocking solution. And incubate the sections in a humidity chamber at room temperature for one hour.Add the appropriate antibodies, diluted one to 500 in blocking solution, to the sections and incubate overnight at four degrees Celsius. On the following day, wash the sections three times for 10 to 15 minutes each with 0.1%PBST. Add appropriate secondary antibodies diluted one to 1000 in blocking solution containing DAPI solution at room temperature for one hour.Next, wash the slides three times with one milliliter of 0.1%PBST for 10 minutes each. After the last wash, add aqueous mounting medium. Cover with a coverslip.And then proceed with confocal microscopy. After retinal immunostaining at E16, 5mC signal was strong in chromocenters of the cell nuclei and present at a much lower level in the whole cell nuclei. 5hmC staining was exclusively found in the cell nuclei and absent from the chromocenters.In P0 retina, both 5mC and 5hmC signals were present in the outer neuroblast layer, and inner neuroblast layer. 5mC signal was strong in the chromocenters and nuclear periphery of the cell nuclei, and weaker in between the chromocenters of cell nuclei. 5hmC staining was restricted to the cell nucleus.In P15 retina, in the outer nuclear layer, 5mC signal was detected in the chromocenters of the cell nuclei and nuclear periphery. Whereas 5hmC signal was in the whole cell nuclei except for the chromocenters. In the inner nuclear, and ganglion cell layer, 5mC signal was strong in the chromocenters of the cell nuclei, and weak in whole cell nuclei.Whereas the 5hmC signal was found in the whole cell nuclei except for the chromocenters. In adult rod photoreceptors, the 5mC signal was limited to the chromocenter and nuclear periphery, whereas 5hmC signal was restricted to the nuclear periphery. While attempting this procedure, it's important to remember to treat histological sections with the optimal exposure of HCl, which is 30 minutes.If the exposure is less or more, then optimal results can not be reproducible. Following this procedure, other methods, like high pressure liquid chromatography, mass spectrometry can be performed in order to answer additional questions like quantification of changes in measuring 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of neural development to explore epigenetic changes in chromatin.Don't forget that working with HCl and PFA can be extremely hazardous, and precautions, such as proper disposal, should always be taken while performing this procedure.