המחברים יש אין התודות.

1. הכנת לוחות תא
הערה: הכינו את הצלחות תא 3–4 שבועות לפני המדידה של השפעות סמים.
<ol><li>יום 0 של הניסוי הערה: למטרות תכנון, היישום מורכבות הבדיקה יכולה להתבצע בכל יום בין ימים 22–28 של הניסוי.<ol>
<li>להפעיל את המים הרותחים ב 37 מעלות צלזיוס, לחמם 40 מ של ציפוי בינוני (כפי שסופק על-ידי היצרן). הערה: השתמש בתאים עם שסופק על-ידי הספק תואמים ותחזוקה של תרבות התקשורת שלהם.</li>
		<li>להפשיר את hiPSC-ס מ על-ידי הצבת את cryotubes המכיל תאים קפוא באמבט מים למשך 2 דקות.</li>
		<li>העבר את המתלים תא 1 מ"ל בקפידה צינור חרוטי 50 מ.</li>
		<li>לשטוף כל cryotube עם 1 מ"ל של ציפוי חמה בינוני כדי לאחזר את שאריות תאי ולהוסיף התקשורת שטיפת הצינור חרוט באותה מתאי המכיל שלב 1.1.3.</li>
		<li>מערבבים בזהירות אחר 8 מ ל בינוני ציפוי חמים לתוך התליה תא.</li>
		<li>לספור תאים חיים באמצעות השיטה הדרה trypan blue ו- hematocytometer8. הערה: לדרישה של 6 x 106 תאים עבור לוח אחד של התא 384-ובכן שוקלת את האפשרות של עד 20% תאים מתים בין תאי קפוא, זה מקסימום מניסיוננו.</li>
		<li>להתאים את התליה תא 5 x 105 בשידור חי תאים/מ עם המדיום ציפוי חמים.</li>
		<li>להפיץ התליה תא לתוך שתי צלחות תא 384-טוב על-ידי הוספת 25 µL מכל קידוח (כ 12,500 תאים לכל טוב). הערה: הלוחות תא לא צריך להיות precoated עם כל מטריצה (ראה דיון).</li>
		<li>לשמור על הלוחות תא ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום 1 של הניסוי<ol>
<li>הפעל את המים הרותחים 37 ° C, חמים 50 מ של תחזוקה בינוני בתוספת 1% פתרון סטרפטומיצין פניצילין v/v.</li>
		<li>החלף את המדיום ציפוי µL 50 של תחזוקה חמים במדיום כל טוב של הלוחות התא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ימים 2–21 (עד יום 27) של הניסוי הערה: hiPSC-CMs לא צריך שום passaging במשך תקופה זו, כפי שהן ללא חלוקת תאים.<ol>
<li>לחדש חצי של המדיום תחזוקה כל 2–3 ימים, לחדש אותו לחלוטין על ימים 7, 14, ו- 21. הערה: ניתן לבצע מדידת קרינה פלואורסצנטית בין ימים 22 ו- 28 של הניסוי. משכי זמן ארוכים יותר לא נוסו אך עדיין עשויים להיות בסדר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה של כלי נגינה, מתחם לוחות Assay צלחות
הערה: להכין את כלי הנגינה, מתחם לוחות, ואת וזמינותו צלחות ביום של המדד של השפעות סמים, בין ימים 22 ו- 28 של הניסוי. להשתמש בקורא צלחת פלורסנט מצויד עם בקרת טמפרטורה ואור של זריחה המתאים המסנן קיט ו עירור מקור. לדוגמה, השתמש ערכת מסנן קרינה פלואורסצנטית Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 (עירור: 472 ננומטר; פליטה: 520–560 ננומטר) ו- 150 W עירור מקור אור יחידה.
<ol><li>לפחות שעתיים לפני הלוח התא הראשון יש למקם בתוך לקורא צלחת על המדידה, להפעיל את הקורא ולהגדיר מערכת החימום ב 37 º C. הערה: גם ניתן לבצע זאת ערב קודם.</li>
	<li>הכינו את הפקדים חיובית forskolin, N6-cyclopentyl-אדנוזין, E-4031 כפתרונות מניות של 0.33 מ מ דימתיל סולפוקסיד, 10 מ מ דימתיל סולפוקסיד ולאחר 3.33 מ מ ב- H2O, בהתאמה. הערה: מלאי פתרונות להיות מדולל 333-fold בזמן הוספתן על התאים, ואת המטרה היא להשיג ריכוזי המבחן האחרון 1 מיקרומטר forskolin, 30 מיקרומטר N6-cyclopentyl-אדנוזין, ו- 10 מיקרומטר E-4031, אשר מייצרים תופעות אמין לשחזור.</li>
	<li>הכנת תרכובות מבחן 352 כפתרונות מניות דימתיל סולפוקסיד בריכוזים 333-fold המבחן המתוכנן (למשל, 10 מ מ עבור מבחן 30 מיקרומטר). הערה: המטרה היא להשיג ריכוז סופי של 0.3% (v/v) דימתיל סולפוקסיד בצלחת תא לאחר היישום מורכב; זהו הריכוז הגבוה ביותר דימתיל סולפוקסיד שאינה משפיעה על פעילות אומנותית cardiomyocytes. הפתרונות מניות ניתן גם להכין יום לפני. מינימום של 5 µL של פתרון מניות נדרשת עבור כל אחת מהמידות כפולים.</li>
	<li>הכינו את הצלחות במתחם.<ol>
<li>חמים 40 מ של תחזוקה בינוני בתוספת 1% פתרון סטרפטומיצין פניצילין v/v לטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להפיץ לתוך שתי צלחות 384-ובכן מורכבים על-ידי הוספת µL 1.5 של מניות פתרון לכל טוב: i) תרכובות מבחן (שתי בארות כל), ii) את הפקדים חיובי (forskolin N6-cyclopentyl-אדנוזין, E-4031, מארבע בארות כל לכל צלחת מתחם) ו- iii) שלילי שליטה (דימתיל סולפוקסיד, בארות 20 לכל צלחת מורכב).</li>
		<li>Centrifuge הלוחות מורכבים ב x 100 g עבור 1 דקות.</li>
		<li>להוסיף µL 37 תחזוקה בינוני בטמפרטורת החדר מכל קידוח (3.9% דימתיל סולפוקסיד ב- 38.5 µL בשלב הזה).</li>
		<li>Centrifuge הלוחות מורכבים ב x 100 g עבור 1 דקות.</li>
		<li>לטעון את הצלחות מתחם לקורא צלחת. הערה: השלבים הבאים צריכה להתבצע בהקדם האפשרי כדי למזער את אידוי לוחית מורכבים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו את הפלורסנט.<ol>
<li>הפעל את המים הרותחים 37 ° C, חם 100 מ של תחזוקה בינוני בתוספת 1% פתרון סטרפטומיצין פניצילין v/v.</li>
		<li>לשקם את הפלורסנט Ca רגיש ואת כ'חטיף עם 10 מ"ל של תחזוקה חמה בינוני עם אנטיביוטיקה. הערה: בינוני פלורסצנטיות מניות מכילה הפלורסנט של Ca-רגיש, בדרך כלל Fluo-4 וכ'חטיף, ניתן לאחסן כל שארית ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים לפחות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. חדרי קירור והקפאה
הערה: לבצע רכישת נתונים ביום של המדד של השפעות סמים. לבצע צעדים 3.1–.10 לחלוטין עבור הלוח התא הראשון, ולאחר מכן חזור על אותם עבור הלוח התא השני.
<ol><li>הפעל את תוכנת קורא צלחת (במידת הצורך) ולטעון את העצות pipet.</li>
	<li>התאם את הגדרות התוכנה להקליט קטע 2 דקות של סידן גלי עם תדירות רכישה לפחות 10 הרץ כדי להגדיר את קצב המכות בסיסית עבור כל טוב.</li>
	<li>לצלחת תא אחד, לדלל 3 מ"ל של זריחה מניות בינוני לתוך 12 מ של תחזוקה חמה בינוני עם אנטיביוטיקה כדי להפוך המדיום זריחה.</li>
	<li>החלף µL 20 בינוני היטב כל צלחת תא µL 30 פלורסצנטיות בינוני.</li>
	<li>פיפטה למעלה ולמטה x 1 לערבב.</li>
	<li>מקם את הצלחת תא לקורא צלחת מהר ככל האפשר לתת להתאקלם הטמפרטורה של hiPSC-ס מ.</li>
	<li>המתן עד 60 דקות לפני התחלת רכישת נתונים.</li>
	<li>התחל רכישת נתונים בתוכנת reader צלחת להקליט קטע 2 דקות של Ca גלים עם תדירות רכישה לפחות 10 הרץ, כדי להגדיר את התוכנית הבסיסית פועם בקצב במשך כל. הערה: עבור כל רצף הקלטה, לוודא הצלחת תא לא מועברים באופן אוטומטי מתוך המכשיר לאחר הרכישה נתונים. פעולה זו מונעת את הצלחת תא קירור בטמפרטורת החדר. עם גירסאות מסוימות של תוכנת קורא צלחת, ייתכן צורך לעצור את כל הקלטת לפני שהיא נגמרת לגמרי כדי להשיג זאת.</li>
	<li>להוסיף את תרכובות בדיקה ועיון עם הרובוט קורא צלחת על-ידי pipetting µL לובכן 5 מהצלחת המורכב המשקולת תא (לאחר תוספת, ריכוז דימתיל סולפוקסיד הוא 0.3% [וי/v]).</li>
	<li>להתחיל רכישת נתונים בתוכנת reader צלחת כדי להקליט 2 דקות מקטעים של Ca גלי החל על 5, 15, 30, 45 ו- 60 דקות לאחר הוספת תרכובת (הקפד בכל פעם הצלחת תא נשאר במכשיר).</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
הערה: ניתוח הנתונים יכול להתבצע בכל עת לאחר המדידה.
<ol><li>ייצוא הנתונים הגולמיים עבור כל תקופת הקלטה בתוכנת reader צלחת כמו קבצי טקסט מסוג ASCII.</li>
	<li>לייבא את הנתונים הגולמיים לתוך התוכנה ניתוח נתונים.</li>
	<li>כל טוב, כל הזמן נקודות, לחלץ מכות הראשית בתדירות. הערה: עם התוכנה ניתוח הנתונים המופיעים בטבלה של חומרים, להכות התדרים ניתן לחשב עם תרגיל ניתוח מותאם אישית באמצעות הפונקציה LombPeriodogram, המבוסס על שיטת לומב – Scargle של ניתוח ספקטרלי ריבועים7 . יש לחשב את periodogram עבור טווח התדרים בין 0.01 ל- 5 הרץ. התדר הראשי יכול להיות מופק את periodogram באמצעות את רוטינות PeakAutoFind. שיטה זו ניתוח מספקת מדידות מדויקות יותר של פועם תדרים מאשר השיטה שסופק כאפשרות עם התוכנה קורא צלחת. עם זאת, האחרון עדיין יכולים לשמש אם התאמה אישית תוכנה זו לא אופציה.</li>
	<li>ייצוא התדרים מכות העיקרי עבור כל תקופת ההקלטה מתוך התוכנה ניתוח נתונים כמו עותקים הלוח או קבצי טקסט מסוג ASCII.</li>
	<li>לייבא התדרים הראשי מכות בתכנת על-ידי הדבקה מהלוח או ייבוא קובץ טקסט. הערה: ניתן לבצע צעדים 4.5–4.9 שבכל תוכנה מודרני של גיליון אלקטרוני.</li>
	<li>עבור כל טוב, לנרמל בסיסית התדר מכות בכל נקודה בזמן לאחר היישום סמים (5, 15, 30, 45, 60 דקות) על-ידי חלוקת התדר מכות העיקרי באותו הזמן הצבע לפי תדירות מכות הראשי בנקודת ההתחלה.</li>
	<li>לחשב את ההשפעה דימתיל סולפוקסיד רעה בכל נקודה בזמן לאחר היישום סמים (5, 15, 30, 45, 60 דקות) על-ידי חישוב ממוצע ערכי מנורמל בשביל הבארות 20 שבו הוחלה דימתיל סולפוקסיד.</li>
	<li>עבור כל טוב, בכל פעם הצבע לאחר היישום סמים (5, 15, 30, 45, 60 דקות), לחסר רשע דימתיל סולפוקסיד אפקט (תואם זמן) באותה הצלחת.</li>
	<li>ממוצע המדידות כפולים. הערה: אם תרכובת משתנה תדירות או התוכנה לא מוצאת תדר הראשי לאחר התוספת מורכבים, בדיקה ויזואלית של התבנית פועם ניתן להעריך אם המתחם המיוצר הפרעות בקצב הלב.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li><li>Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance-based+detection+of+beating+rhythm+and+proarrhythmic+effects+of+compounds+on+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).</li><li>Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+their+derivatives:+a+renaissance+in+cardiovascular+translational+research.">Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).</li><li>Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li><li>Sube, R., Ertel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+An+In-Vitro+Model+to+Predict+Cardiac+Effects+of+Drugs.">Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs.</a> Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23 (2017).</li><li>Sirenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+in+vitro+assessment+of+compound+effects+on+cardiomyocyte+physiology+using+iPSC+cells.">Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).</li><li>VanderPlas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Lomb-Scargle+Periodogram.">Understanding the Lomb-Scargle Periodogram.</a> Cornell Univeristy Library. , (2017).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Ertel, E. A., Godfraind, T., Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+blockers+and+calcium+channels.">Calcium channel blockers and calcium channels.</a> Calcium Channel Blockers. , 11-80 (2004).</li><li>Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+potassium+channels+by+antiarrhythmic+and+antihypertensive+drugs.">Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs.</a> Hypertension. 19, 228-236 (1992).</li><li>Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium+Toxins+and+Their+Interactions+with+Voltage-Gated+Sodium+Ion+Channels.">Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels.</a> Marine Drugs. 15 (10), (2017).</li><li>Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li><li>Puppala, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+in+human-induced+pluripotent+stem+cell--derived+cardiocytes+and+human+and+cynomolgus+heart+tissue.">Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue.</a> Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שני ההיבטים הם הקריטיים ביותר עבור ההקלטה מוצלחת בנצחונך תדרים. הראשון הוא לנהוג בזהירות עם ציפוי תא והתרבות. בפרט, חשוב ולנסות להימנע מגרד את שכבת תאים בתחתית הבארות כאשר להחלפת המדיום. זה מקובל לגעת בקרקעית הבארות עם מדי סוכר, אבל באותה הזווית אמור לשמש בכל פעם, ובכך לייצר רק שריטה קטנה בשכבה תא, לא להשפיע על ביצועי וזמינותו. הפן הקריטי השני להשגת מקצבים הומוגנית לשחזור נועד לספק בקרת טמפרטורה טוב ב 37 מעלות צלזיוס על פני הלוח התא משך זמן המדידה. אנחנו לא היתה אפשרות לקבל הומוגניות זו באמצעות להתקנים אחרים לקורא לצלחת משמש כאן, אבל זה יכול להיות ריאלי עם שינויים מיוחדים הסדרת טמפרטורה: זה יעשה את פרוטוקול המובאת כאן להפכה שמיש מעבר מותג יחיד של צלחת הקורא. כדי להשיג יציבות טמפרטורה משך זמן הניסוי עם ההתקן המשמש כאן, היה צורך לעצור את כל הקלטת לפני שזה נגמר; אחרת, הרובוט תוציא את הצלחת תא נמדד. בעיה טכנית זו עשויה להיעלם עם המהדורה הבאה של תוכנת קורא צלחת, אבל זה נשאר קריטי כרגע. צלחת תא בטעות הועבר מחוץ לקורא צלחת, לטעון אותו פנימה מהר ככל האפשר. למרות זאת, האיכות של הניסוי יחריף, בגלל שינויי טמפרטורה משפיעה על קצב פעימות במהירות רבה מאוד.
כמה היבטים נוספים, שלא נבדקו ביסודיות, אשר עשוי להיות פחות חשובה. לדוגמה, hiPSC-ס"מ יצרנים ממליצים ציפוי תרבית תאים צלחות לפני זריעה התאים, אך assay הספציפי הזה, ציפוי לא שימשה, כי התאים לדבוק די בקלות על משטחים שונים, וזה קשה מאוד כראוי את המעיל 384-ובכן צלחות. ובכל זאת, ציפוי תא צלחת עדיין ייתכן המותר, או זה אפילו עשוי לשפר את איכות וזמינותו. גם לא בדקנו אם ממיסים חוץ דימתיל סולפוקסיד יהיה מקובל, אך הוא צפוי מתוך ניסיון עם טכנולוגיות אחרות של הקלטה כי ריכוזי דומה EtOH או MeOH גם יהיה נסבל. אנחנו בדרך כלל משתמשים hiPSC-CMs מאותו יצרן, נבדקו תאים מן הספק נוסף אחד בלבד, אשר הופיע לעבודה באופן דומה. כמו כן, השתמשנו רק מספר קטן של קבוצות שונות של hiPSC-CMs אשר נבחרו על ידי prechecking אותם כדי לוודא התנהגו באופן דומה על החבילה ההתחלתית. אחד או שניים אצוות נחשבו בלתי הולם כי syncytia שלהם היו יציבות או הפארמצבטית בתנאים תרבות המשמש כאן. אחרת, פרמקולוגיה הופיע דומה מאוד על פני אצוות בעת בדיקת פאנל מוגבלת של תרכובות "טיפוסי" (forskolin, N6-cyclopentyl-אדנוזין, ו E-4031, כמו גם endothelin, isoproterenol, amlodipine ו ponesimod). השתמשנו רק hiPSC-ס"מ נגזר מתורמים מאוד בריאים. זה יכול להיות כדאי להעריך אם hiPSC-ס"מ נגזר בחולים עם מחלת לב יספק תוצאות שונות, אם כי אין הבדל בין התורמים בריאים וחולים נצפתה בעת הערכת את cardiotoxicity של מעכבי טירוזין קינאז 12. לבסוף, אנחנו בדרך כלל לחכות 22-28 ימים בתרבות לפני מדידתה סמים: מניסיוננו עם עכבה הקלטות של התאים אותו, מצב יציב בשביל להאט עכבה (מדד היציבות שכבת תאים) מהיר עכבה (מצביע על להכות תדר) ניתן להגיע לאחר 12–15 ימים בתרבות. עם זאת, החלטנו לחכות 22–28 ימים, כי זו הפעם כאשר הפרופיל ביטוי של ערוצי לב וסמנים ההבשלה התייצב13. זה לא נבדק אם ניתן להשיג תוצאות דומות אם התאים שימשו מוקדם או מאוחר יותר.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמשת יחידת מידה מאוד פשוט הקצב הפועם ספונטנית של hiPSC-ס"מ כדי להעריך את פוטנציאל השפעות סמים על אלקטרופיזיולוגיה הלב האנושי. יתרונות עיקריים על פני שיטות אחרות הן כי i). זה נוטה סביבת ההקרנה תפוקה גבוהה, ii) היא מתעדת את הפעילות של cardiomyocytes, את השפעות הסמים על טמפרטורות פיזיולוגית ו iii) הוא אינו דורש ההתמחות אלקטרופיזיולוגיות להוצאה להורג או הערכה של תוצאות.
במחקר אימות שנערך עם הרבה תרופות המאושרות לשימוש בבני אדם, הראינו כי וזמינותו מגיב תרופות המשמשות ברפואה האנושית כפי שחזיתי מאת נתונים קליניים קיימים5. כי שיטה זו מייחסת כל תופעות אפשריות על קצב הלב, זה משלים את מקיף במבחנה Proarrhythmic assay (CiPA) היזמה14 הבודק באופן ספציפי פוטנציאל pro-הפרעות לב.
בעתיד, שיטה זו יכול לספק הבנה נוספת של מצב-של-הפעולה של תרופות הראו משפיעה על קצב המכות ספונטנית. סביר כי פרטים נוספים מכניסטית הוא נוכח ההקלטות זריחה של Ca שנחשולי (למשל, משרעת או צורה). אם ההקלטות פלורסצנטיות מבוצעות במחירים רכישה גבוה יותר (למשל, 30 הרץ), פרמטרים אלה מופקים בקלות בנוסף פועם בקצב, זה יכול להיות מעניין לתאם שינויים בפרמטרים האלה עם השפעות ידועות תרופות בשימוש קליני.

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למדידת השפעות סמים בתדר מכות ספונטנית של syncytia של hiPSC-ס מ במקצבים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. תאי גזע pluripotent אנושית-induced יכולים להתמיין cardiomyocytes פונקציונלי הקובעים באופן ספונטני המכות syncytia במבחנה1,2,3,4. אלה hiPSC-ס מ ניתן להשיג במספרים גדולים דרך ספקי מסחרי או ייצור במעבדה, והם מקור שימושי של תאים כדי ליצור מודלים של פיזיולוגיה של הלב האנושי ו פרמקולוגיה. בפרט, הם יכולים לשמש כדי לחזות או כדי לאפיין את ההשפעות לב שעלולות להתרחש כאשר התרופה ניתנת בני5.
ניתן למדוד תדירות הפועם של syncytia hiPSC-ס מ בתנאים פיזיולוגיים באמצעות microelectrode מערכים או עכבה חישה1: טכניקות אלה לא פולשנית לספק מידע מפורט מאוד על השפעות סמים, אבל הם מעדיפים תפוקה נמוכה והם לא מאפשרים בדיקות ספריות מתחם גדול בתוך אילוצי תקציב וזמן מציאותי. מערכת יעילה יותר יכול להיות פירט באמצעות פלורסצנטיות 384-ובכן הדמיה צלחת הקורא, Ca-רגיש לצבוע6, אך הקוראים צלחת קלאסית אתה מוגבל בשל בקרת טמפרטורה שיוצרת ותדירות רכישה. מגבלות אלה הן מאויר על ידי מכות unphysiological המחירים (bpm ~ 15, לעומת 35-55 bpm בסביבות מבוקרות1) ו- Ca אות רזולוציה נמוכה (תדירות רכישה 8 הרץ היא על הגבול התחתון תעריפי שיא שיכול להגיע 120 bpm בתנאים מגורה, זה לא יכול לחלץ מידע כגון מדרון או משך). השיטה המתוארת כאן משלב את ההקלטה בנצחונך דפוסי מקצבים פיזיולוגיים, ברזולוציה מספיק כדי למנוע חששות אלה.
בצד החיובי, שיטה זו היא תפוקת פשוטה, אמינה וגבוה, המאפשר בדיקה מהירה של מספר רב של תרכובות בעלויות סבירות. בצד השלילי, שיטה זו מחייבת קורא מהר צלחת עם בקרת טמפרטורה אפקטיבית, המהווה השקעה יקרה, והוא מספק מידע מכניסטית קצת על תופעות שנצפו סמים, אשר עשויים להצריך בדיקה נוספת עם יותר מפורט שיטות.
6 hiPSC שנהנתם 6 x 10 ס מ יש צורך מדידה אחת בצלחת תא אחד של 384-. טוב. hiPSC-ס מ בדרך כלל מסופקים מסחרית כמו aliquots הקפוא של ~ 4 x 10 תאים6 ב 1 מ"ל. לכן, זה נוח להכין שתי צלחות תא עם שלושה aliquots קפוא. ברוב המקרים, לאור ההשתנות הנמוך של assay הזה, זה מספיק כדי לבצע מדידות כפולות של תרכובות המבחן ולאחר בצלחת לכל תא, quadruplicate המידות של הפקדים חיובי (forskolin, N6-cyclopentyl-אדנוזין, E-4031), ו מידות 20-plicate של הפקד שלילי (לבד דימתיל סולפוקסיד). לכן, ניתן להעריך מקסימום של 352 תרכובת/ריכוז זוגות עם שתי צלחות תא 384-. טוב. להלן כללי התנהגות מחשיב ניסוי כזה עם תרכובות מבחן 352, שתי צלחות תא ותאים 12 מיליון שסופק כמו שלושה aliquots קפוא; זה יכול להיות בקלות קנה המידה-up אם נקודות נתונים נוספים נדרשים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FDSS7000 fluorescent plate reader</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>not a catalog item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td></td>
			<td>installed initially 
			in the device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 temperature control</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A10118-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>C11653-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDSS7000 pipet tips for 384-well plates</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>A8687-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes</td>
			<td>Hamamatsu Photonics 
			(Massy, France)</td>
			<td>U8524-12</td>
			<td>optional alternative to the Igor Pro software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro data analysis software</td>
			<td>Wavemetrics 
			(Portland, Oregon, USA)</td>
			<td>Latest version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td>
			<td>Cellular Dynamics International (Madison, WI)</td>
			<td>R1106</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cor.4U Cardiomyocyte Kit</td>
			<td>Ncardia Germany 
			(Cologne, Germany)</td>
			<td>Ax-B-HC02-4M</td>
			<td>includes cells, plating and maintenance media 
			alternative to the iCell-Cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well cell culture plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well compound plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>781280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 4 Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices 
			(Sunnyvale, California)</td>
			<td>R8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-cyclopentyl-adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich 
			(Buchs, Switzerland)</td>
			<td>C8031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-4031</td>
			<td>Enzo Life Sciences 
			(Lausen, Switzerland)</td>
			<td>BML-KC158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher 
			(Reinach, Switzerland)</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractions of human-ipsc-derived cardiomyocyte syncytia measured with a ca-sensitive fluorescent dye in temperature-controlled 384-well plates

באופן ספונטני קבלנות syncytia של cardiomyocytes נגזר pluripotent אנושית-induced תאי גזע (hiPSC-ס מ) הם מודל שימושי של פיזיולוגיה של הלב האנושי ו פרמקולוגיה. שיטות שונות הוצעו כדי להקליט את פעילות ספונטנית זו וכן להעריך השפעות סמים, אבל מרבית השיטות האלה סובלים תפוקה מוגבלת ו/או פיזיולוגית הרלוונטיות. פיתחנו מערכת הקרנה תפוקה גבוהה כדי לכמת את ההשפעות של תרכובות אקסוגני בתדר הפועם של hiPSC-ס"מ, באמצעות הפלורסנט רגיש Ca וצלחת רב טוב קורא הדמיה טמפרטורה מבוקרת. אנו מתארים כיצד להכין את הצלחות תא והלוחיות מתחם וכיצד להפעיל את הבדיקה האוטומטי כדי להשיג רגישות גבוהה הפארמצבטית. אנחנו גם מתארים כיצד להפוך ולנתח את הנתונים פלורסצנטיות לספק אמין למדידת השפעות סמים על קצב ספונטנית. Assay הזה יכול לשמש בתוכניות גילוי סמים כדי להנחות אופטימיזציה כימי, או אליו, תרכובות המשפיעים על תפקוד הלב האנושי.

איור 1 מציג הקלטה נציג של Ca גלי בסיסית על פני לוח 384-טוב אחד. ברוב המקרים, כל בארות לחשוף קצב פעימות רגילים עם השתנות קטן על פני הצלחת (זאת אומרת ± SD = 40.1 ± 3.5 bpm; טווח = bpm 34-54). לעתים רחוקות (פחות מ 1 מתוך 10 ניסויים), כמה בארות (פחות מ 5) יש לי הפרעה בקצב הלב או היעדרות של קצב. ב שלוש צלחות 384-. ובכן, ניסינו גם cardiomyocytes הספק אחר (ראה טבלה של חומרים) והשיג ערכים דומים מאוד בסיסית עבור המכות ספונטנית.
חוסמי של תעלות יונים הלב משפיע על הקצב של cardiomyocytes ב לשחזור האופן5. Amlodipine, חוסם איטי Ca ערוצים9, מאיצה את קצב יותר מ 100% באופן תלוי-ריכוז עד 1 מיקרומטר (איור 2 א). התוצאה היא התפתחה גם במרחק 5 דקות קודם, אבל היא עדיין מגבירה שנהנתם 50% בתוך הבא 30 דקות לפני זה מייצבת. מעל 1 מיקרומטר, מעצרים amlodipine המכות (קווים מקווקווים), כפי שניתן לצפות מן העובדה אותה רשות אישורים רכיבה על אופניים היא קריטית כדי הצירים ספונטנית. חוסמי ערוצים אחרים dihydropyridine סלקטיבית Ca לייצר תופעות דומות מאוד.
E-4031, חוסם ערוצי יישור מושהית מהירה K10, מואטת הקצב בערך 65–70% באופן תלוי-ריכוז עד 10 מיקרומטר (איור 2B). האפקט מפתחת במרחק 5 דקות קודם, הוא אינו משתנה בתוך הבא 60 דקות. חוסמי IKr סלקטיבית אחרים לייצר תופעות דומות, למרות הפחתה מירבית במחיר יכול להשתנות (למשל, 35–40% עבור cisapride, 70% עבור E-4031 ו- 90% - 95% עבור dofetilide). בסיס פער לא ידוע.
טטרודוטוקסין, חוסם מהר נה ערוצים11, מואטת הקצב כ 15% באופן תלוי-ריכוז, עד–1 30 מיקרומטר (איור 2C). התוצאה היא התפתחה גם במרחק 5 דקות קודם, הוא אינו משתנה בתוך הבא 60 דקות. עם זאת, מעל 30 מיקרומטר, טטרודוטוקסין מעצרים המכות בתוך 5 דקות הראשונות, ואילו לאחר 30 דקות, זה מעצרים זה מעל 1 מיקרומטר. חוסמי ערוצים אחרים נה, כגון לידוקאין או mexiletine, לייצר אפקטים לימים דומה.
Bepridil, חוסם מעורבות של הלב Na, Ca, ו- K ערוצים9, מייצרת גם אפקט המותנה (איור דו-ממדי). הדבר מצביע על הכנת, חסימה של תעלות Na היא הפעולה העיקרי של bepridil. האצה עקב Ca ערוץ בלוק לא ראיתי ומופיעה מתקדמת יותר בעקבות IKr בלוק רעולי פנים על ידי ההשפעה ערוץ נה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> איור 1: נציג בסיסית Ca גלים על פני צלחת 384-ובכן. (א) כל בארות על פני הצלחת להדגים שיעור מכות רגילות עם השתנות הקטן. תמונה זו נתפס ישירות מתוך התוכנה קורא צלחת. כל זכר הוא 10 s במשך. עוצמת קרינה פלואורסצנטית הוא שרירותי (יחסית קלות יחידות נגזר על סולם גוני אפור מצלמת וידאו). מעקב s (B) זה מתנפחת 10 אחד מראה את רעש נמוכה של האות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> איור 2: ייצוגית השפעות יון לב ערוץ חוסמי. לוחות אלה מציגות עקומות הריכוז-תגובה עם (א') סלקטיבי Ca ערוץ חוסם amlodipine, חוסם הפריטים המוקפצים (ב') IKr סלקטיבית E-4031, (ג) את נה סלקטיבי ערוץ חוסם TTX, ואת (D) בערוץ לא בררניים bepridil חוסם הפריטים המוקפצים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates at JoVE.com

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

באופן ספונטני קבלנות syncytia של cardiomyocytes נגזר pluripotent אנושית-induced בתאי גזע הם שימושיים דגמי פיזיולוגיה של הלב האנושי ו פרמקולוגיה. כאן אנו מציגים מערכת הקרנה תפוקה גבוהה כדי לכמת את ההשפעות של תרכובות אקסוגני על להכות תדר, באמצעות הפלורסנט רגיש Ca וצלחת רב טוב קורא הדמיה טמפרטורה מבוקרת.

התכווצויות של האדם iPSC-נגזר Cardiomyocyte Syncytia נמדד עם תיוג הפלורסנט Ca הרגישים ב טמפרטורה מבוקרת צלחות 384-ובכן

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפרמקולוגיה של בטיחות הלב. לדוגמה, האם תרופה אנושית חדשה נושאת סיכון לשינוי קצב הלב הרגיל? היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי זה יכול להעריך מספר גדול של תרכובות במהירות ובמחיר מתון.הדגימה של ההליך תהיה קמיל פוני, עמיתת מחקר במעבדה שלי. כדי להתכונן למדידת הצירים של סינקטיה של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי אדם, או HIPSCCMs, להתחיל על ידי הצבת CryoTubes המכיל תאים קפואים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. העבר את כל ההשעיה המופשרת מכל צינור לצינור חרוט אחד, טרי 50 מיליליטר.כדי לאחזר את שאריות התאים, לשטוף כל צינור עם מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס מראש ציפוי בינוני ולהוסיף את המדיום הזה לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל תאים מופשרים. מוסיפים שמונה מיליליטר של מדיום ציפוי חם לצינור ומערבבים בזהירות את ההשעיה. השתמש בשיטת אי-הכללה כחולה של trypan ובהמוציטומטר כדי לספור תאים חיים.על ידי הוספת מדיום ציפוי חם, להתאים את הריכוז ל 50, 000 תאים למיליליטר. כדי להפיץ את התאים לשני לוחות תרבות תאים חדשים של 384 בארות, הוסף 25 מיקרוליטרים לכל באר, אשר יניבו כ -12, 500 תאים ל הבאר. הדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 384 צלחות גם באטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו חמצני במשך סך של שלושה עד ארבעה שבועות.למחרת, להחליף את המדיום ציפוי עם 50 microliters של מדיום תחזוקה חמה. לאחר מכן, החלף מחצית מדיום התחזוקה כל יומיים עד שלושה ימים. בימים שבע, 14 ו-21, החלף את המדיום לחלוטין.לאחר התאים נשמרו בתרבות במשך שלושה עד ארבעה שבועות, הם יצרו באופן ספונטני התכווצות syncytia, ואת ההשפעה של תרכובות על התכווצויות אלה ניתן למדוד. ביום ההסקה, לפחות שעתיים לפני לוחית התא הראשונה היא להיות ממוקם בתוך קורא הלוח למדידה, להפעיל את הקורא ולהגדיר את מערכת החימום ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להכין את הלוחות המורכבים, חם לטמפרטורת החדר 40 מיליליטר של אמצעי תחזוקה בתוספת 1% נפח לפי נפח פניצילין סטרפטומיצין.בעוד המדיום מתחמם, להפיץ את תרכובות הבדיקה ואת הפקדים לתוך שתי 384 צלחות מורכבות היטב על ידי הוספת 1.5 microliters של פתרון מלאי ל הבאר. צנטריפוגה צלחות המתחם ב 100 G לדקה אחת. מוסיפים 37 מיקרוליטרים של אמצעי תחזוקה לכל באר וצנטריפוגה את הצלחות שוב ב 100 G לדקה אחת.כדי להכין את הצבע הפלואורסצנטי, חם 100 מיליליטר של מדיום תחזוקה בתוספת 1% נפח לפי נפח פניצילין סטרפטומיצין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיליליטר של המדיום החם לתערובת של צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן וקוונצ'ר כדי להפוך אותם מחדש כמדיום פלואורסצנטי מלאי. הפעל את תוכנת קורא הלוחות.הכינו את התוכנה לתיעוד קטע של שתי דקות של גלי סידן בתדירות רכישה של לפחות 10 הרץ. כדי להפוך את הפלואורסצנטיות לבינונית עבור כל צלחת תא, לדלל שלושה מיליליטר של מדיום פלואורסצנטי מלאי עם 12 מיליליטר של מדיום תחזוקה חם עם אנטיביוטיקה. החלף 20 microliters של בינוני בכל באר של צלחת התא עם 30 microliters של מדיום פלואורסצנטי ומערבבים על ידי צינורות למעלה ולמטה פעם אחת.מיד לאחר מכן, מקם את הלוחית לקורא לוחות כדי לאפשר ל- HIPSCCMs להתאים את עצמם לטמפרטורת הקורא למשך 60 דקות. לאחר מכן, הפעל את תוכנת קורא הלוחות. הקלט קטע של שתי דקות של גלי סידן עם תדירות רכישה של לפחות 10 הרץ כדי להגדיר את קצב המכות הבסיסי עבור כל באר.חשוב לוודא שלוח התא אינו מועבר אל מחוץ למכשיר לאחר רכישת נתונים. עם גירסאות תוכנה מסוימות, עליך להפסיק את ההקלטה לפני שהיא מסתיימת לחלוטין. השתמש ברובוט קורא הלוחות כדי pipette חמישה microliters של הבדיקה התייחסות תרכובות היטב לתוך הלוח מורכב לתוך לוח התא.לאחר מכן, התחל את רכישת הנתונים בתוכנת קורא הלוחות כדי להקליט שני מקטעים דקה של גלי סידן החל מחמש, 15, 30, 45 ו - 60 דקות לאחר התוספת המורכבת. כדי להתחיל בניתוח נתונים, יצא את הנתונים הגולמיים עבור כל תקופת הקלטה מתוכנה של קורא הלוחות בקבצי טקסט של ASCII. ואז לייבא אותם לתוכנה לניתוח נתונים.מתוך תוכנת ניתוח הנתונים, יצא את תדרי המכות העיקריים עבור כל תקופת הקלטה כ עותקי לוח. לחלץ את תדירות המכות העיקרית עבור כל באר ובכל נקודת זמן. לבסוף, יבא את התדרים המכות לתוכנה גיליון אלקטרוני על-ידי הדבקת הלוח והמשך בניתוח הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.הקלטה של גלי סידן בבסיס על פני צלחת אחת 384 היטב מראה כי ברוב המקרים כל הבארים לחשוף שיעור מכות רגיל עם שונות קטנה על פני הצלחת. כאשר חוסמי תעלות יון לב מתווספים, הם משפיעים על הקצב של cardiomyocytes. Amlodipine, חוסם של תעלות סידן איטי, מאיץ את הקצב יותר מ 100% באופן תלוי ריכוז עד מיקרומולר אחד.ומעל זה, אמלודיפין עוצר את המכות. E-4031, חוסם של תעלות אשלגן מתקן מושהה מהירה מטהר את הקצב על 65 עד 70% באופן תלוי ריכוז עד 10 micromolar. Tetrodotoxin, חוסם של תעלות נתרן מהירה מאט את הקצב על 15% באופן תלוי ריכוז עד אחד עד 30 micromolar, ואילו מעל 30 micromolar, tetrodotoxin עוצר את המכות בתוך חמש הדקות הראשונות.Bepridil, חוסם מעורב של תעלות נתרן לב, סידן ואשלגן מייצר גם אפקט של הכל או כלום, מה שמרמז כי בלוק ערוץ נתרן הוא הפעולה העיקרית של bepridil. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות עדין מאוד בעת צינורות בצלחת תרבות התא. רקמות אלה הם שבירים מאוד פגום בקלות אם נגע על ידי פיפטים.אל תשכח כי עבודה עם תאים אנושיים וסמים פעילים יכול להיות מסוכן, אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות בטיחות ומשקפיים תמיד צריך לקחת בעת ביצוע הליך זה.

התכווצויות של האדם iPSC-נגזר Cardiomyocyte Syncytia נמדד עם תיוג הפלורסנט Ca הרגישים ב טמפרטורה מבוקרת צלחות 384-ובכן

Abstract