وقد تم دعم هذا العمل قبل الفنلندي الثقافية مؤسسة (H.L.)، "تامبيري السل مؤسسة" (H.L.، ل. م. ف. M.M.H.، عضو البرلمان)، مؤسسة "الرابطة الفنلندية" لمكافحة السل (سومن توبيركولوسين فاستوستاميسيهديستيكسين Säätiö) (H.L.، M.M.H.، عضو البرلمان)، سيغريد Jusélius مؤسسة (عضو البرلمان)، إميل ألتونن مؤسسة (M.M.H.)، وجين ومؤسسة أركو آتوس (عضو البرلمان) وأكاديمية فنلندا (عضو البرلمان). لينا ماكينن، بيبو لينا حنا وجينا Ilomäki معترف بها للمساعدة التقنية. يعترف الكتاب المختبر الزرد تامبيري لخدمتهم.

جميع التجارب التي الزرد أقرها "المجلس تجربة الحيوان" في فنلندا (ESAVI/8245/04.10.07/2015). أساليب تجري وفقا للقانون (497/2013) والمرسوم الحكومي (564/2013) المتعلق بحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية أو تعليمية في فنلندا.
1-استزراع بكتريا مارينوم
ملاحظة: نظراً لبكتريا مار?...

هنا يصف لنا تطبيق يستند إلى qPCR لقياس الأحمال المتفطرات من الحمض النووي المستخرج من الأنسجة المصابة تجريبيا الزرد الكبار. يستند هذا التطبيق على كبسولة تفجير تصميم حول تسلسل الداخلية يدون مباعدة الرنا الريباسي 16S-23S40. ويقدر مجموع الحمل المتفطرات في عينة أسماك استخدام منحنى قيا?...

الزرد (دانيو rerio) نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية، ونموذج مقبولة لعلم الأحياء الفقارية شيوعاً. الزرد وقد تم تكييف العديد من مجالات البحوث نمذجة الأمراض البشرية واضطرابات تتراوح بين1 من السرطان وأمراض القلب2 العدوى والدراسات المناعية لعدة البكتيرية 3 و4 من العدوى الفيروسية , 5-وبالإضافة إلى ذلك، قد أحرزت التنمية السابقين الرحم الأجنة الزرد الزرد نموذج شعبية في علم الأحياء التنموي6 وعلم السموم7،8.
في العديد من مجالات البحوث، بما في ذلك الإصابة بالبيولوجيا، ويشيع استخدام اليرقات الزرد شفافة بصريا. تظهر الخلايا المناعية الأولى داخل ح 24 وظيفة التسميد (hpf)، عندما الضامة البدائية هي الكشف عن9. العَدلات هي الخلايا المناعية التالية تظهر حوالي 33 هبف10. وهكذا قابلة اليرقات الزرد للدراسة في المراحل المبكرة من العدوى، ودور الحصانة الفطرية في غياب الخلايا المناعية التكيفية11. ومع ذلك، يوفر الزرد الكبار مع نظامها المناعي التكيفي تعمل بكامل طاقتها طبقة إضافية من التعقيد لتجارب العدوى. يمكن كشف خلايا تي حول 3 أيام بعد الإخصاب12، وب الخلايا قادرة على إنتاج أجسام مضادة الوظيفية قبل 4 أسابيع بعد الإخصاب13. وقد الزرد الكبار جميع النظراء الرئيسيين لنظام المناعة الفطرية وتكيفية الثدييات. تم العثور على الاختلافات الرئيسية بين immune systems الأسماك والبشر في إيسوتيبيس جسم فضلا عن تشريح الأنسجة اللمفاوية. وقد الزرد جسم سوى ثلاثة فصول14، بينما البشر لديهم خمسة15. نظراً لغياب نخاع العظام والغدد الليمفاوية، الأجهزة اللمفاوية الأولية في الأسماك هي الكلي و الغدة الصعترية16 والطحال، والكلى والقناة الهضمية بمثابة أجهزة اللمفاوية الثانوية17. وعلى الرغم من هذه الاختلافات، مع ترسانتها حصانة كاملة من الخلايا الفطرية وقابلة للتكيف، الزرد الكبار نموذج العالية المطبقة، وسهلة الاستخدام، وغير الثدييات لدراسات التفاعل المضيف الممرض.
الزرد أنشئت في الآونة الأخيرة نموذجا عمليا لدراسة السل18،،من1920،،من2122. السل مرض الهواء الناجم عن بكتريا السل. ووفقا "منظمة الصحة العالمية"، السل تسبب1.7 مليون حالة وفاة في عام 2016، وهو السبب الرئيسي للوفاة ممرض واحد في جميع أنحاء العالم23. الفئران24،25، الأرانب26 و27 من المقدمات غير البشرية نماذج الحيوان الأكثر شهرة في بحوث السل لكن كل وجه قصورها. يشبه نموذج الرئيسيات غير البشرية من الإصابة السل م الأمراض البشرية الأكثر تطابقاً، ولكن استخدام هذا النموذج محدودة بسبب اعتبارات أخلاقية خطيرة. نماذج حيوانية أخرى تعيق المضيف-خصوصية السل م الذي يؤثر على باثولوجيا المرض. طائفة واسعة من نتائج الإصابة والمرض في الأمراض البشرية على الأرجح أكبر مشكلة في نمذجة السل: السل مرض متغايرة جداً تتراوح من تعقيم الحصانة للإصابة الكامنة والنشطة والمعاد تنشيطها28 ، التي يمكن أن يكون من الصعب استنساخها ونموذج تجريبيا.
متفطره مارينوم قريب من السل م مع أورثولوجوس ~ 3,000 البروتينات بنسبة 85 في المائة من الأحماض الأمينية الهوية29. وبطبيعة الحال يصيب M. marinum الزرد المنتجة حبيبية، السمات المميزة لمرض السل، في19،الأجهزة الداخلية في30. خلافا لسائر النماذج الحيوانية المستخدمة في بحوث السل، الزرد تنتج ذرية كثيرة وأنه يتطلب مساحة محدودة فقط والأهم من ذلك، أنها نيوروفيسيولوجيكالي نموذج السل الفقاريات أقل البلدان نمواً المتاحة. بالإضافة إلى ذلك، تسبب العدوى M. marinum العدوى الكامنة، والمرض النشطة أو التعقيم حتى الإصابة المتفطرات في الزرد الكبار عن كثب محاكاة طيف نتائج مرض السل البشري19، 31 , 32-هنا، يمكننا وصف أساليب لنموذج تجريبي السل الزرد الكبار بحقن M. marinum في تجويف البطن واستخدام PCR الكمي لقياس الأحمال المتفطرات والاستجابات المناعية من الزرد عينات الأنسجة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mycobacterium marinum</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H10 agar</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11799042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock OADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H9 medium</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11753473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock ADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS20 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican 100 30G insulin needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9151133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml homogenization tube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13119-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mm ceramic beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13114-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, ETAX Aa</td>
			<td>Altia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277</td>
			<td>FW 118.2 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613859</td>
			<td>FW 294.1 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>FW 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR118</td>
			<td>Guanidine thiocyanate-phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer24 homogenizator</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator m08</td>
			<td>Finnsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-98005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR 96-well plate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically transparent film</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10666421</td>
			<td>decontamination reagent eliminating RNases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast Eva Green master mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish

متفطره حاليا الممرض البشرية فتكاً مما تسبب في وفاة 1.7 مليون والتهابات 10.4 مليون سنوياً. يسبب التعرض لهذه البكتيريا طائفة واسعة من أمراض في البشر تتراوح بين عدوى معقمة مرض القاتل تتقدم بنشاط. الشكل الأكثر شيوعاً هو السل الكامنة، التي هي غير متناظرة، ولكن لديه القدرة على إعادة تنشيط في مرض مداهم. مؤخرا أثبتت الزرد الكبار والممرض الطبيعية بكتريا مارينوم تكون نموذجا ينطبق على دراسة الطيف واسعة من مرض السل. الأهم من ذلك، يمكن دراسة الكمون عفوية وإعادة تنشيط، فضلا عن الاستجابات المناعية التكيفية في سياق الإصابة المتفطرات في هذا النموذج. في هذه المقالة، نحن تصف طرق العدوى التجريبية للكبار الزرد، جمع الأجهزة الداخلية لاستخلاص الأحماض النووية لقياس الأحمال المتفطرات والاستجابات المناعية المضيف قبل PCR الكمي. في-منزل--وضعت، M. marinum-مقايسة qPCR محددة أكثر حساسية من الأساليب التقليدية والطلاء، كما يكشف أيضا الحمض النووي من المتفطرة غير تقسيم أو نائمة أو ميتة مؤخرا. كما يتم استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من نفس الشخص، فمن الممكن لدراسة العلاقات بين الدولة المريضة، والتعبير الجيني المضيف والممرض. النموذج الزرد الكبار للسل وهكذا تقدم نفسها على أنها نظام التطبيق عالية وغير الثدييات في فيفو لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض.

الممرض الأسماك الطبيعية marinum متفطره يصيب الأجهزة الداخلية من الزرد وينتج من عدوى المجموعية مع حبيبية الأشيع مرئية19. الزرد البالغين المصابين M. marinum بحقنه داخل. يتم استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، وتحميل المتفطرات تقاس بكمية تفاعل البو...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish at JoVE.com

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

نقدم هنا، بروتوكولا للسل البشري النموذجي في الزرد الكبار استخدام به الممرض الطبيعية متفطره marinum. استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الأجهزة الداخلية من الزرد المصابة يمكن أن تكشف عن مجموع المتفطرات الأحمال في الأسماك والاستجابات المناعية للمضيف مع قبكر.

السل النمذجة في "الزرد الكبار المصابين" بكتريا مارينوم

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السل مثل ما هو دور الاستجابات المناعية التكيفية والعوامل المسببة للمرض من هذا المرض متعدد العوامل. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة قاعدة حمض نووي هو أن كل من الأحمال البكتيرية ومستويات التعبير الجيني يمكن قياسها من نفس الفرد. لبدء هذا الإجراء، الثقافة M.marinum على لوحة 7H10 كما هو موضح في بروتوكول النص.نقل 10 ملليلترات من 7H9 المتوسطة التي تحتوي على تخصيب ADC، polysorbate 80، والجلسرين إلى قارورة ثقافة الخلية. ثم، استخدام حلقة تطعيم ميكروليتر واحدة عقيمة لنقل اخصوم واحد loopful من كتلة البكتيريا M.marinum في القارورة. اترك الغطاء فضفاضًا أو استخدم غطاء فلتر للسماح بتبادل الغاز الكافي وثقافته عند 29 درجة مئوية في الظلام دون أن تهتز لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام حتى يصل OD600 إلى حوالي 0.7.تمييع ومواصلة زراعة البكتيريا على النحو المبين في النص. للبدء في إعداد الحل البكتيري للعدوى ، قم بنقل ملليلتر واحد من الثقافة إلى أنبوب جديد. جهاز طرد مركزي عند 10,000 غرام لمدة ثلاث دقائق.إزالة عظمى وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة. باستخدام برنامج تلفزيوني معقمة مع 0.3 ملليغرام لكل ملليلتر من الفينول الأحمر كمتتبع، وتمييع التعليق للوصول إلى التركيز البكتيري المطلوب. بعد هذا، استخدم حقنة ملليلتر واحدة لسحب التعليق ببطء من خلال إبرة قياس 27 ثلاث مرات.تنفيذ هذه الخطوة فقط قبل استخدامها لكل aliquot. أولا، ماصة خمس قطرات ميكرولتر من الحل البكتيري المخفف على قطعة من فيلم البارافين. ثم، سحب قطرة إلى إبرة الأنسولين قياس 30.استخدام سمكة عمرها خمسة إلى ثمانية أشهر لهذه التجربة مع واحد يجري الأسماك من النوع البري والآخر يجري خرقة الأسماك المتحولة. ضع هذه الأسماك الجانب البطني في الشقوق من قطعة من البلاستيك الرطب الرغوية. حقن إبرة الأنسولين بين زعانف الحوض في زاوية 45 درجة.الحفاظ على إبرة فتح صعودا لضمان أن الفتحة بأكملها داخل تجويف البطن. ثم، حقن ببطء المحلل البكتيري. بعد ذلك، قم بإزالة الإبرة بعناية ونقل الأسماك على الفور إلى خزان استعادة مملوءة بمياه الخزانات العذبة.أخذ عينات من aliquot البكتيرية في استخدام كل 15 دقيقة على 7H10 لوحات. احتضان هذه العينات في 29 درجة مئوية لمدة خمسة أيام للتحقق من جرعة العدوى. تحقق من رفاهية الأسماك بانتظام، والتأكد من القتل الرحيم أي الأسماك مع أعراض العدوى عن طريق احتضان لهم في الماء مع أكثر من 0.02٪ من 3-أمينوبنزويك حمض الإيثيل استر.بعد القتل الرحيم الأسماك، إدراج دبوس الخلفي للأشعة برانتيوستيغال. إدراج دبوس الثاني من خلال الذيل إلى تك السمك على منصة. باستخدام مشرط، افتح تجويف البطن بأكمله.ثم، استخدام ملعقة صغيرة وملاقط حادة النهاية لجمع الأجهزة الداخلية بدءا من القلب والعمل على طول العمود الفقري نحو الذيل لفصل جميع الأعضاء الداخلية في كتلة واحدة. استخدام ملاقط لفصل شبكة الأمعاء من كلواكا ونقل الأعضاء إلى أنبوب التجانس 1.5 ملليلتر تحتوي على نصف دزينة من الخرز السيراميك 2.8 ملليمتر. ضع الأنبوب على الفور على الثلج الجاف لتجميد العينة.تخزين العينة في درجة مئوية سلبية 80 حتى تصبح جاهزة لتجانس. بعد استخراج الحمض النووي والرنا، وقياس الأحمال الفطرية بواسطة PCR الكمية كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يصاب حمار وحشي بالغ مع M.marinum عن طريق حقن داخل الصفاق.وينظر إلى جرعة عالية من العدوى تؤدي إلى مرض التدريجي الذي الحمل الفطرية لا تزال في ازدياد حتى الحمل المتوسط يصل إلى حوالي خمسة ملايين بكتيريا في نهاية المطاف قتل الأسماك. جرعة منخفضة من ناحية أخرى يؤدي إلى تطوير طيف المرض مماثلة لتلك التي ينظر إليها في السل البشري مع تقدمية, كامنة, إعادة تنشيط, وتعقيم العدوى. في هذه الحالة ، يستمر الحمل في الزيادة لمدة أربعة أسابيع بعدها يصل المرض إلى حالة ثابتة في غالبية الأسماك.وتكشف هذه البيانات أن العدد الأولي من البكتيريا المفطرة المستخدمة لإصابة الأسماك هو محدد حاسم لنتائج العدوى. وينظر إلى حمار وحشي متحولة خرقة لتكون قادرة على الحد بشكل كاف من نمو البكتيريا الفطرية مما يؤدي إلى ارتفاع الأحمال البكتيرية وزيادة المراضة. وهذا يدل بوضوح على أهمية مناعة التكيف في السيطرة على العدوى الفطرية.مستويات إنترلوكين-4 هي أعلى بكثير في مجموعة نوع البرية تكشف عن أن الاستجابة التكيفية مطلوبة لإدخال الفعال من interleukin-4، ولكن يمكن الاستغناء عنها لإدخال إنترفيرون غاما بعد العدوى الفطرية. هذا البروتوكول يتيح جمع كل من الحمض النووي والرنا من نفس العينة مما يجعل من الممكن الجمع بين عبء mycobacterial للعينة مع بيانات التعبير الجيني لكل من المضيف والبكتيريا. ويمكن الجمع بين هذه التقنية مع إدارة الأدوية أو المرشحين للقاحات لتقييم تأثيرها على الأحمال الفطرية والاستجابات المناعية.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر اتباع المبادئ التوجيهية المحلية للسلامة الشخصية والتخلص من النفايات عند العمل مع عامل أمراض من المستوى الثاني للسلامة الحيوية. هذه التقنية يجعل من الممكن لدراسة كل من السل النشط والكامن مع mycobacteria نائمة في حمار وحشي الذي هو غير الثدييات الأخلاقية في نموذج vivo.