עבודה זו היא נתמכה על ידי פינית תרבותית קרן (מרגשת), קרן שחפת טמפרה (ה. ל., ל'-M.V., M.M.H., ד. נ), הקרן של האגודה נגד שחפת פינית (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (מרגשת, M.M.H., ד. נ), סיגריד Jusélius קרן (ד. נ), אמיל Aaltonen קרן (M.M.H.), ג'יין, קרן Erkko Aatos (ד. נ), האקדמיה של פינלנד (ד. נ). לינה Mäkinen, חנה-לינה Piippo, ג'נה Ilomäki הם הכירו לסיוע טכני שלהם. המחברים להכיר המעבדה דג זברה טמפרה עבור השירות שלהם.

כל דג זברה ניסויים אושרו על ידי מועצת המנהלים ניסוי חיה ב פינלנד (ESAVI/8245/04.10.07/2015). שיטות מבוצעות על פי החוק (497/2013) צו ממשלתי (564/2013) בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות או חינוכי בפינלנד.
1. culturing של התחממות עולמית
הערה: מאחר התחממות עולמית חיידק המסוג?...

כאן נתאר יישום מבוסס-qPCR כדי למדוד המון mycobacterial מ- DNA מופק דג זברה בוגרת השפעול נגוע רקמות. יישום זה מבוסס על תחל עוצב סביב ה 16-23S rRNA פנימי מרווח משועתקים רצף40. העומס mycobacterial הכולל דוגמאות הדגים מוערכת באמצעות עיקול רגיל שהוכנו מ- DNA מופק מספר ידוע של mycobacteria בתרבית, בהנחה שהחיידק אח?...

דג זברה (רזבורה rerio) הוא מודל בעל חיים הנמצא בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי וזה מודל מקובל עבור הביולוגיה חוליות נפוצות. דג זברה הותאם לשדות רבים של מחקר מידול מחלות אנושיות, הפרעות ועד סרטן1 ומחלות לב2 זיהום ולימודי אימונולוגי של מספר חיידקים 3 וזיהומים וירליים4 , 5. בנוסף, הפיתוח לשעבר עם רחם של דג זברה עוברי גרם דג זברה מודל פופולרי ב ביולוגיה התפתחותית6 וטוקסיקולוגיה7,8.
בתחומים רבים של מחקר, כולל זיהום ביולוגיה, הזחלים דג זברה שקוף אופטית משמשים. תאי מערכת החיסון הראשון להופיע בתוך 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf), כאשר מקרופאגים פרימיטיביים שזוהו9. הנויטרופילים הם תאים חיסוניים הבאה תופיע hpf סביב 3310. דג זברה הזחלים הם לפיכך ריאלי עבור לימוד בשלבים המוקדמים של הזיהום ואת התפקיד של חסינות מולד בהיעדרו של תאים חיסוניים מסתגלת11. עם זאת, דג זברה למבוגרים עם המערכת החיסונית מסתגלת באופן תקין שלה מספק שכבה חדשה של מורכבות לניסויים זיהום. תאי T ניתן להבחין סביב 3 ימים לפרסם הפריה12, ואף בתאי B מסוגלים לייצר נוגדנים תפקודית 4 שבועות-פוסט-דישון-13. דג זברה למבוגרים יש את כל עמיתיהם העיקריים של המערכת החיסונית יונקים, מולדת, גמישים. ההבדלים העיקריים בין את immune systems של דגים ובני נמצאים נוגדנים isotypes באותה מידה כמו האנטומיה של רקמות הלימפה. דג זברה יש נוגדנים רק שלושה שיעורים14, ואילו לבני האדם יש חמש15. בהיעדרו של מח העצם ואת בלוטות הלימפה, איברי הלימפה העיקרי ב הדג הכליה ואת ה התימוס16 הטחול, הכליה, הבטן לשמש איברי הלימפה משני17. למרות הבדלים אלה, עם ארסנל מלא המערכת החיסונית שלה של תאים מולדת, גמישים, דג זברה למבוגרים הוא מודל מאוד רלוונטי, קל לשימוש, ללא מידע יונקים ללימודי אינטראקציה פתוגן-פונדקאי.
דג זברה הוקם לאחרונה כמודל אפשרי ללמוד שחפת18,19,20,21,22. השחפת היא מחלה מוטס הנגרמת על ידי שחפת Mycobacterium. על פי ארגון הבריאות העולמי, שחפת גרמה1.7 מיליון מקרי מוות של 2016, והוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם פתוגן יחיד23. עכברים24,25, ארנבים26 וקופים27 הם שהחיה הידועים מודלים במחקר שחפת אבל כל המגבלות שלהם. המודל אנושיות הפרימטים לזיהום מ. שחפת דומה המחלה האדם הקרוב ביותר, אבל באמצעות מודל זה הוא מוגבל בשל שיקולים אתיים רציני. דגמים בעלי חיים אחרים הם מוגבל בשל המארח-יחודיות של מ. שחפת המשפיעה על המחלה פתולוגיה. כנראה הבעיה הגדולה ביותר ב דוגמנות שחפת הוא המגוון הרחב של תוצאות בזיהומים ומחלות של המחלה האנושית: השחפת היא מחלה מאוד הטרוגנית החל לחיטוי חסינות נסתר, פעיל, שהופעלה מחדש זיהום28 , אשר יכול להיות קשה לשחזר את מודל השפעול.
התחממות עולמית הוא קרוב משפחה של מ. שחפת עם חלבונים orthologous ~ 3000 עם 85% חומצה אמינית זהות29. התחממות עולמית מ מדביק באופן טבעי דג זברה לייצר גרנולומות, גולת הכותרת של שחפת, ב19,האיברים הפנימיים שלה30. בניגוד דגמים בעלי חיים אחרים השתמשו במחקר שחפת, דג זברה מייצר צאצאים רבים, היא דורשת רק מקום מוגבל, חשוב, זה neurophysiologically המודל שחפת חוליות שהיזמים זמינים. בנוסף, הזיהום מ התחממות עולמית גורם חבויה, מחלה פעילה או אפילו עיקור של זיהום mycobacterial דג זברה בוגרת מקרוב מחקה את הספקטרום של המחלה תוצאות של שחפת אנוש19, 31 , 32. כאן, אנו מתארים שיטות עבור הדגם שחפת ניסיוני של דג זברה למבוגרים על ידי הזרקת התחממות עולמית מ לתוך חלל הבטן באמצעות PCR כמותי כדי למדוד המון mycobacterial של תגובות חיסוניות של דג זברה דגימות רקמה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mycobacterium marinum</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H10 agar</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11799042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock OADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H9 medium</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11753473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock ADC enrichment</td>
			<td>BD, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11718173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS20 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican 100 30G insulin needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9151133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml homogenization tube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13119-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8 mm ceramic beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>13114-325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, ETAX Aa</td>
			<td>Altia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine thiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9277</td>
			<td>FW 118.2 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1613859</td>
			<td>FW 294.1 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (free base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>FW 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR118</td>
			<td>Guanidine thiocyanate-phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer24 homogenizator</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator m08</td>
			<td>Finnsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-98005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR 96-well plate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>HSP9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically transparent film</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10666421</td>
			<td>decontamination reagent eliminating RNases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast Eva Green master mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>172-5211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling tuberculosis in mycobacterium marinum infected adult zebrafish

שחפת mycobacterium נמצא כעת הקטלני פתוגניות גורם 1.7 מיליון מקרי מוות וזיהומים 10.4 מליון בכל שנה. חשיפה חיידק זה גורם ספקטרום רחב המחלה בבני אדם ועד זיהום סטיריליים מחלה קטלנית מתקדם באופן פעיל. הצורה השכיחה ביותר היא ראגנטים, אשר ללא תסמינים, אבל יש את היכולת להפעיל מחדש לתוך מחלה לפתח. דג זברה למבוגרים ופתוגן הטבעי שלה, התחממות עולמית לאחרונה הוכיחו להיות מודל החל ללמוד את קשת רחב מחלת השחפת. חשוב לציין, השהיה ספונטנית, הפעלה מחדש, כמו גם תגובות מערכת החיסון מסתגלת בהקשר של זיהום mycobacterial ניתן יהיה ללמוד במודל זה. במאמר זה, אנו מתארים שיטות זיהום ניסיוני של דג זברה למבוגרים, האוסף של איברים פנימיים להפקת חומצות גרעין לשקילת נטען mycobacterial, מארח תגובות מערכת החיסון על ידי ה-PCR כמותי. In-הבית מפותחות, ספציפית qPCR assay מ התחממות עולמית -רגיש יותר מאשר בשיטות ציפוי מסורתי בעת גם זיהוי ה-DNA של mycobacteria ללא הפרדה, רדום או מת לאחרונה. כמו גם DNA ו- RNA המחולצים באותו הפרט, זה אפשרי ללמוד את קשרי הגומלין בין המדינה חולה, את המחשב המארח ופתוגן, ביטוי הגנים. המודל דג זברה בוגרת שחפת וכך מציג את עצמו כמערכת מאוד רלוונטי, ללא מידע יונקים ויוו ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי.

המחלה טבעי דגים התחממות עולמית משפיע על האיברים הפנימיים של דג זברה ומייצרת זיהום מערכתי עם גרנולומות בהיסטולוגיה גלוי19. דג זברה בוגרת נגועים מ התחממות עולמית על ידי זריקה בקרום הבטן. ה-DNA ו RNA המחולצים ולאחר העומס mycobacterial נמדד על ידי כמותיים תגובת ש...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish at JoVE.com

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שחפת אנוש מודל דג זברה למבוגרים באמצעות הפתוגן הטבעי שלה, התחממות עולמית. חילוץ DNA ו- RNA של האיברים הפנימיים של דג זברה נגוע יכול לשמש כדי לחשוף את שהסכום הכולל mycobacterial טוען את הדגים, של המחשב המארח תגובות מערכת החיסון עם qPCR.

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השחפת כגון מהו התפקיד של תגובות חיסוניות אדפטיביות ואת הפתוגנזה של מחלה רב-תכליתית זו. היתרון העיקרי של שיטת בסיס זו של חומצת גרעין הוא שניתן למדוד הן עומסים חיידקיים והן רמות ביטוי גנים מאותו אדם. כדי להתחיל בהליך זה, תרבות M.marinum על לוח 7H10 כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.מעבירים 10 מיליליטר של מדיום 7H9 המכיל העשרת ADC, פוליסורבט 80 ו גליצרול לבקבוקון של תרבות התא. לאחר מכן, השתמש בלולאת חיסון מיקרוליטר אחת סטרילית כדי להעביר באופן בלתי יעיל לולאה אחת של מסת חיידקי M.marinum לתוך הבקבוק. השאירו את המכסה רופף או השתמשו בכובע מסנן כדי לאפשר החלפת גז ותרבות מספקת ב-29 מעלות צלזיוס בחושך מבלי לרעוד במשך שלושה עד ארבעה ימים עד שה-OD600 יגיע לכ-0.7.לדלל ולהמשיך culturing החיידקים כמתואר בטקסט. כדי להתחיל להכין את הפתרון החיידקי לזיהום, להעביר מיליליטר אחד של התרבות לתוך צינור טרי. צנטריפוגה ב-10,000 גרם לשלוש דקות.הסר את supernatant ו resuspend גלולה במיליליטר אחד של PBS סטרילי. באמצעות PBS סטרילי עם 0.3 מיליגרם למיליליטר של פנול אדום כמעקב, לדלל את ההשעיה כדי להגיע לריכוז החיידק הרצוי. לאחר מכן, השתמש מזרק מיליליטר אחד כדי למשוך לאט את ההשעיה דרך מחט 27 מד שלוש פעמים.בצע שלב זה ממש לפני השימוש עבור כל aliquot. ראשית, פיפטה טיפה חמישה מיקרוליטר של פתרון חיידקי מדולל על פיסת סרט פרפין. לאחר מכן, משוך את טיפת לתוך מחט אינסולין 30 מד.השתמש בדג בן חמישה עד שמונה חודשים לניסוי זה כאשר אחד מהם הוא דג בר והשני הוא דג מוטנט סמרטוטים. מקם את הצד הגחוני של הדגים האלה בחתך של חתיכת פלסטיק מוקצף לח. להזריק את מחט האינסולין בין סנפירי האגן בזווית של 45 מעלות.שמור את המחט נפתחת כלפי מעלה כדי להבטיח כי הפתח כולו הוא בתוך חלל הבטן. לאחר מכן, לאט להזריק את הפתרון החיידקי. לאחר מכן, להסיר בזהירות את המחט מיד להעביר את הדגים למיכל התאוששות מלא מי מיכל טרי.קח דגימות מן aliquot חיידקי בשימוש כל 15 דקות על צלחות 7H10. דגירה דגימות אלה ב 29 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים כדי לאמת את מינון הזיהום. בדוק את רווחתם של הדגים באופן קבוע, הקפד המתת דם כל דגים עם תסמיני זיהום על ידי דגירה אותם במים עם יותר מ 0.02% של 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר.לאחר המתת חום הדג, הכנס סיכה אחורית לקרני הענף. הכנס סיכה שנייה דרך הזנב כדי לתקל את הדגים על הרציף. באמצעות אזמל, לפתוח את כל חלל הבטן.לאחר מכן, השתמש בכף קטנה ובפינצטה חדה כדי לאסוף את האיברים הפנימיים המתחילים בלב ועובדים לאורך עמוד השדרה לכיוון הזנב כדי לנתק את כל האיברים הפנימיים בבלוק אחד. השתמש פינצטה כדי לנתק את רשת המעיים מן cloaca ולהעביר את האיברים לתוך צינור הומוגניזציה 1.5 מיליליטר המכיל חצי תריסר 2.8 מילימטר חבילות קרמיקה. מיד מניחים את הצינור על קרח יבש כדי להקפיא את הדגימה.לאחסן את המדגם ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד מוכן הומוגניזציה. לאחר חילוץ הדנ"א וה-RNA, למדוד את העומסים mycobacterial על ידי PCR כמותי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, דגי זברה בוגרים נגועים M.marinum על ידי זריקה תוך-חוץ-לידתית.מינון זיהום גבוה נראה להוביל למחלה מתקדמת שבה העומס mycobacterial ממשיך להגדיל עד העומס הממוצע מגיע על חמישה מיליון חיידקים בסופו של דבר להרוג את הדגים. מינון נמוך לעומת זאת מוביל להתפתחות ספקטרום מחלות דומה לזה שנראה בשחפת אנושית עם זיהומים מתקדמים, סמויים, מחדש ועיקור. במקרה זה, העומס ממשיך לעלות במשך ארבעה שבועות שלאחריה המחלה מגיעה למצב יציב ברוב הדגים.נתונים אלה מגלים כי המספר הראשוני של mycobacteria המשמש להדביק את הדג הוא דטרמיננטה קריטית לתוצאות הזיהום. דגי זברה מוטנטים נראים לא מסוגלים להגביל במידה מספקת את הצמיחה של mycobacteria המוביל עומסים חיידקיים גבוהים יותר ותחלואה מוגברת. זה ממחיש בבירור את החשיבות של חסינות אדפטיבית בשליטה על זיהום mycobacterial.רמות interleukin-4 גבוהות באופן משמעותי בקבוצת סוג הבר חושף כי התגובה הסתגלות נדרשת עבור הקדמה יעילה של interleukin-4, אבל לוותר על כניסתה של גמא אינטרפרון לאחר זיהום mycobacterial. פרוטוקול זה מאפשר איסוף של דנ"א ו-RNA מאותה דגימה המאפשר לשלב את הנטל המיקובקטריאלי של המדגם עם נתוני ביטוי גנים של המארח והחיידקים. טכניקה זו יכולה להיות משולבת עם הממשל של תרופות או מועמדים לחיסון כדי להעריך את השפעתם על עומסים mycobacterial ותגובות חיסוניות.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר ההנחיות המקומיות לבטיחות אישית וסילוק פסולת בעת עבודה עם פתוגן ברמה biosafety 2. טכניקה זו מאפשרת ללמוד שחפת פעילה וגם סמויה עם מיקובקטריה רדומה בזברהפיש שהיא לא יונקת אתית במודל vivo.