Bu eser KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc ve Ulusal Araştırma Vakfı Kore (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396) tarafından desteklenmiştir. Y. Jo KAIST başkanlık Bursu ve Asan Vakfı Biyomedikal Bilim bursu destek kabul eder.

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım KAIST Komitesi (KA2010-21, KA2014-01 ve KA2015-03) onay altında yapıldı. Bu çalışmada tüm deneylerin onaylı kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. lenfosit izolasyon fare kan
<ol><li>C57BL/6J fare CO2 inhalasyon yolu ile ötenazi, 26-G iğne fare kalp içine yerleştirin ve 0.3 mL kan toplamak. Doğrudan kan fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 1 mL sulandırılmış 100 U/mL heparin...

Biz mevcut 3D nicel faz görüntüleme ve makine öğrenimi istismar lenfosit türleri etiket içermeyen tanımlaması etkinleştiren bir iletişim kuralıdır. Bu protokol kritik adım nicel faz görüntüleme ve Özellik seçimi vardır. En iyi holografik görüntüleme için hücre yoğunluğu yukarıda açıklandığı gibi kontrol edilmesi gerekmektedir. Hücrelerin mekanik sağlamlık da yüzen veya titreşim hücresel hareketleri aydınlatma açısı değişiklikleri üzerine hologram ölçümleri rahatsız etmeye...

Lenfositler B, yardımcı (CD4 +) T, sitotoksik (CD8 +) T ve düzenleyici T de dahil olmak üzere çeşitli alt türleri gizli hücreleri. Lenfosit türlerinin farklı bir rol içinde edinilmiş bağışıklık sistemi vardır; Örneğin, T lenfositler belirli antijenleri tespit etmek, anormal hücreler ortadan kaldırmak ve B lenfositler düzenleyen oysa B lenfositler antikor, üretmek. Lenfosit fonksiyon ve yönetmelik sıkıca tarafından kontrol ve kanser1, otoimmün hastalıklar2ve viral enfeksiyonlar3de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar ile ilgili. Böylece, lenfosit türleri tanımlaması gibi hastalıklar ve immünoterapi kliniklerde patofizyolojik rollerini anlamak önemlidir.
Şu anda, yöntemlerini lenfosit türleri sınıflandırmak için belirli yüzey membran proteinlerinin veya yüzey işaretleyicileri4hedefleyerek antijen-antikor reaksiyonlar güveniyor. Yüzey işaretleyicileri hedefleme lenfosit türlerini belirlemek için kesin ve doğru bir yöntemdir. Ancak, pahalı reaktifler ve zaman alıcı yordamlara ihtiyaç duyar. Ayrıca, membran protein yapıları değişiklik ve tadilat hücresel fonksiyonların riskleri taşır.
Bu zorlukları aşmak için burada açıklanan protokol lenfosit türleri (QPI) düşsel 3D nicel faz ve5öğrenme makine kullanarak etiket içermeyen tanımlaması tanıtır. Bu yöntem, bireysel lenfositler etiket ücretsiz 3D görüntüleme dan çıkarılan morfolojik bilgilere dayanarak bir tek hücre düzeyinde lenfosit türleri sınıflandırılması sağlar. Geleneksel floresan mikroskopi teknikleri QPI kırılma indisi (RI) dağılımları (canlı hücre ve dokuların Iç optik özellikleri) optik kontrast6,7olarak kullanır. RI tomograms bireysel lenfositlerin lenfosit alt türleri için özel fenotipik bilgileri temsil eder. Bu durumda, sistemik 3D RI tomograms bireysel lenfositlerin yararlanmak için denetimli makine öğrenme algoritması kullanılmıştır.
Etiket içermeyen, sağladıkları çeşitli QPI teknikler kullanarak, 3D RI tomograms hücre aktif hücre patofizyolojisi çalışma için kullanılmış olan sayısal görüntüleme yeteneği8,9,10, 11,12,13. Ayrıca, tek tek hücreleri 3D RI dağılımları morfolojik, biyokimyasal ve biyomekanik hücreler hakkında bilgi sağlar. 3D RI tomograms daha önce kullanılan alanların Hematoloji14,15,16,17, bulaşıcı hastalıklar18,19, 20, immünoloji21, hücre biyolojisi22,23, iltihap24, kanser25, nörolojik26,27, gelişim biyolojisi28, toksikoloji 29ve Mikrobiyoloji12,30,31,32.
3D RI tomograms detaylı morfolojik ve biyokimyasal bilgilerini hücre sağlasa, sınıflandırma lenfosit alt türlerinden sadece 3D RI tomograms5Imaging tarafından elde etmek zordur. Sistematik ve kantitatif ölçülen 3D RI tomograms Cep tipi sınıflandırma için yararlanmak için bir makine öğrenme algoritması kullanılmıştır. Son zamanlarda, çeşitli eserler nicel hangi aşamada hücreleri görüntülerini analiz edildi öğrenme algoritmaları33mikroorganizmaların34, bakteriyel cins35 sınıflandırılması tespiti de dahil olmak üzere, çeşitli makine ile bildirilmiştir , 36, şarbon sporları37, hızlı ve etiket içermeyen tespiti otomatik analizi sperm hücresi38, kanser hücreleri39,40Analizi ve tespiti makrofaj harekete geçirmek41.
Bu iletişim kuralı etiket içermeyen tanımlaması lenfosit türleri, 3D QPI ve makine öğrenimi kullanılarak tek tek hücre düzeyinde uygulanacak ayrıntılı adımları sağlar. Bu içerir: 1) lenfosit yalıtım fare kan, 2) lenfosit akış sitometresi, 3) 3D QPI, 4) kantitatif Özellik çekme--dan 3D RI tomograms üzerinden sıralama ve lenfosit türlerini tanımlamak için 5) denetimli öğrenme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1100px;" width="1099">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Mouse</td>
			<td style="width:175px;">Daehan Biolink</td>
			<td style="width:344px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td style="width:279px;">gender and age-matched, 6 &#8211; 8 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Falcon conical centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806544-500ML</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ammonium-chloride-potassium lysing buffer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Antibody</td>
			<td style="width:175px;">BD Biosciences</td>
			<td>553140 (RRID:AB_394655)</td>
			<td style="width:279px;">CD16/32 (clone 2.4G2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555275 (RRID:AB_395699)</td>
			<td>CD3&#949; (clone 17A2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>Biolegnd</td>
			<td>100734 (RRID:AB_2075238)</td>
			<td>CD8&#945; (clone 53-6.7)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557655 (RRID:AB_396770)</td>
			<td>CD19 (clone 1D3)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557683 (RRID:AB_396793)</td>
			<td>CD45R/B220 (clone RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552878 (RRID:AB_394507)</td>
			<td>NK1.1 (clone PK136)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0041-85 (RRID:AB_464893)</td>
			<td>CD4 (clone GK1.5)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:279px;">4,6-diamidino-2-phenylindole</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II or III&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging chamber</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoDish</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>HT-1H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography imaging software</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Image professing software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab R2017b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning

Biz burada nicel faz görüntüleme ve makine öğrenimi kullanarak lenfosit alt etiket içermeyen tanımlaması için bir iletişim kuralı tanımlamak. Kimlik lenfosit alt türlerinden İmmünoloji yanı sıra tanı, çalışma ve çeşitli hastalıkların tedavisi için önemlidir. Şu anda, standart yöntemlerini lenfosit türleri sınıflandırmak için belirli zar proteinleri antijen-antikor reaksiyonlar ile etiketleme güveniyor. Ancak, bu etiketleme teknikleri hücresel işlevlerini değiştirme potansiyel riskleri taşır. Burada açıklanan protokol 3D nicel faz görüntüleme ve bir makine öğrenimi algoritması tarafından ölçülen içsel optik tezat sömürerek bu zorlukların üstesinden gelir. 3D kırılma indisi (RI) tomograms lenfositlerin ölçümü 3D Morfoloji ve tek tek hücreler fenotipleri hakkında kantitatif bilgi sağlar. Ölçülen 3D RI tomograms çıkarılan biyofiziksel parametreleri kantitatif etiket içermeyen tanımlaması lenfosit türleri bir tek hücre düzeyinde etkinleştirme bir makine öğrenme algoritması ile incelenir. Biz 3D RI tomograms B, T CD4 + ve CD8 + T lenfositler ölçmek ve onların hücre tipleri ile % 80'den fazla tespit doğruluk. Bu protokol için lenfosit yalıtım, 3D nicel faz görüntüleme ve lenfosit türlerini tanımlamak için makine öğrenimi için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır.

Şekil 1 tüm iletişim kuralı şematik süreci gösterir. Burada sunulan yordamını kullanarak B izole (n = 149), CD4 + T (n 95 =) ve CD8 + T (n = 112) lenfositler. Aydınlatma çeşitli açılarda faz ve genlik bilgilerini elde etmek için her lenfosit birden fazla 2D hologramlar (den-60 ° ile 60 °) aydınlatma açısını değiştirerek ölçüldü. Genelde 50 hologramlar 3D RI tomogram yeniden oluşturmak için kullanılan, ancak görüntüleme h?...

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning at JoVE.com

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Biz lenfosit alt türlerinden nicel faz görüntüleme ve bir makine öğrenimi algoritması kullanarak etiket içermeyen tanımlaması için bir iletişim kuralı tanımlamak. 3D kırılma indisi tomograms lenfositlerin ölçümleri sonra hücre tiplerinin tanımlanması için bir makine-öğrenme algoritması ile analiz edilir 3D morfolojik ve biyokimyasal bilgilerini tek tek hücreler, mevcut.

Etiket içermeyen lenfosit alt türlerinden üç boyutlu nicel faz Imaging'i kullanma tanımlaması ve öğrenme makine

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

Bu yöntem, zaman alan, maliyetli ve numunelerin hücresel işlevini değiştirme riskitaşıyan geleneksel floresan etiketleme ve akış sitometri sitometrisi analizi prosedürüne alternatif sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, hızlı ve doğru lenfosit tanımlamasını sağlayan etiketsiz ve nicel yöntemler olan üç boyutlu refraktif indeks tomografisi ve makine öğrenimidir. Lenfositlerin belirlenmesi gibi bu tekniğin etkileri kan kanserlerinin ve otoimmün hastalıkların tedavisine doğru uzanır hastalık tanısı ve uygun tedavi uygulaması için çok önemli olabilir.Bu yöntem lenfosit popülasyonları içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda bakteriler de dahil olmak üzere ilgi diğer tek hücrelerin analizi için uygulanabilir. Tekniğin nasıl gerçekleştirilebileceğine dair net bir talimatı kolaylaştıran ve uygulamalarına ışık verebildiği için, 3B nicel faz görüntüleme teknolojisinin görsel gösterimi çok önemlidir. Floresan aktive hücre sıralama ile her lenfosit alt toplayarak başlayın.Optimal görüntüleme için, her hücre örneğini RPMI ortamının mikrolitresi başına 180 hücre konsantrasyonuna seyreltin ve yavaş yavaş ilk seyreltilmiş numunenin 120 mikrolitresini bir görüntüleme odasına enjekte edin. Oda içinde kabarcıkların eksikliğini doğruladıktan sonra, 3B kantitatif faz mikroskobunun objektif merceği üzerine bir damla distile su yerleştirin ve görüntüleme odasını mikroskobun çeviri aşamasına yerleştirin. Aşamayı, numunenin nesnel lensle aynı hizaya uyacak şekilde ayarlayın ve sırasıyla nesnel ve kondansatör lenslerin eksenel konumlarını ayarlamak için görüntüleme yazılımının mikroskop perspektifinin kalibrasyon sekmesinde odak ve yüzeye tıklayın.Objektif ve kondansatör lensleri hizalamak için Otomatik mod'a tıklayın. Hizalamayı optimize etmek için Tarama modunu açın ve dijital mikroayna cihaz desenini merkeze hizalamak için lensleri manuel olarak ayarlayın. Ardından, Normal moduna dönün ve görünüm alanında bir hücre bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın.Ekranda görselleştirilen örnek sınır neredeyse görünmez olana kadar odak düzlemini bulmak için objektif lensin eksenel konumunu ayarlayın. En iyi 3DRI tomogramı oluşturmak için hücrenin odak noktasını mükemmel bir şekilde ayarlamak önemlidir. Görüntü düzgün alınmazsa, 3D rekonstrüksiyon bozulur ve bu da gürültülü bir tomograma neden olur.Hücresi olmayan bir konumu bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın ve farklı aydınlatma açılarına sahip birden fazla 2D hologramı ölçmek için Kalibrasyon'u tıklatın. Görünüm alanının merkezinde bir hücre bulmak için çeviri aşamasını ayarlayın. Ve Edinme sekmesinin altında, görüntüalınan örneği adlandırın.Sadece ölçülen 2B hologramlar için aynı aydınlatma açıları kullanarak hücrenin hologramları ölçmek için 3B Snapshot'ı tıklatın. Elde edilen veriler Veri Yönetimi panelinde göründüğünde, görüntüleme yazılımında uygulanan kınık tomografi algoritmasını kullanarak 2B hologramlardan 3B kırılma indisi tomogramını yeniden oluşturmak için verileri sağ tıklatın ve İşlem'i tıklatın. Görüntülemeden sonra, Veri Yönetimi panelinde, verilere sağ tıklayın ve verileri görselleştirmek için Aç'ı tıklatın.Yeniden konumlandırmak için hücrenin ortasını tıklatın ve Veri Yöneticisi panelinde RI Tomogram'ı tıklatın. Önceden Ayarlanmış sekmesinde Yükle'yi tıklatın ve lenfositi çift tıklatın. 3DRI dağılımlarına göre tomogramı görselleştirmek için görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan önceden tanımlanmış bir aktarım fonksiyonu olan xml.Yakınlaştırmak için fareyi kaydırın ve hücreyi herhangi bir yöne döndürmek için sürükleyin. Kantitatif morfolojik ve biyokimyasal özellik çıkarma için tüm tomografik verileri tek bir klasöre yerleştirin ve hücre türlerini ana klasördeki tek tek alt klasörler içinde bölün. Ardından, uygun görüntüleme yazılımındaki ek özellik çıkarma dosyasını açın ve verilerin ayıklanması gereken tomogram klasörünü belirlemek için satır 14'ü düzenleyin.Ayıklanan özellik verilerinin kaydedilen klasörü belirlemek ve kodu yürütmek için satırı 15'i düzenleyin. Veri kümesindeki her tomogram için kod yüzey alanını, hücresel hacmi, herbiri kadar olan protein yoğunluğunu ve kırılma indisi başına kuru kütleyi hesaplar. Denetimli öğrenme ve tanımlama için, çıkarılan özellik verilerini rasgele ayrı eğitim ve test seti klasörlerine bölmek için MATLAB'daki basit rasgele bölme algoritmasını kullanın.Ek eğitim dosyasını açın ve eğitim kümesi klasörünü belirlemek için satırı 14'ü, eğitilen sınıflayıcıyı kaydetmek için klasörü belirlemek için 16 satırını ve sınıflandırıcı için bir dosya adı ayarlamak için 17 satırını düzenleyin. O zaman kodu çalıştır. Eğitim kümesinin seçili özelliklerini kullanarak, kod K en yakın komşu algoritması ile bir sınıflandırıcı eğitir ve sınıflandırıcıyı belirlenen klasöre kaydeder.Ardından, ek test dosyasını üç açın ve test edilecek eğitilmiş sınıflandırıcıyı belirlemek için 14 ile 15 arası satırları ve eğitilmiş test kümesini belirlemek için 17. O zaman kodu çalıştır. Sınıflandırıcı test kümesinde bireysel lenfositlerin hücre tiplerini tanımlar.Burada temsili 3D b lenfositlerin kırılma indeksi tomogramları, CD4 pozitif T lenfositler ve farklı renk şemaları ile CD8 pozitif T lenfositler, görüntüleme yazılımı ile atanan kırılma indeks değerlerine göre tahsis gösterilmiştir. Kırılma indisi değerlerinden nicel morfolojik ve biyokimyasal özellikler hesaplanabilir. Bu deneyde eğitim ve test olgularında T ve B lenfosit sınıflamının doğruluğu sırasıyla %93.15 ve %89.81 idi.CD4 pozitif ve CD8 pozitif T lenfositleri istatistiksel olarak sınıflandırıldı ve doğruluk oranı sırasıyla eğitim ve test setleri için %87.41 ve %84.38 idi. Son olarak, çok sınıflı, hücre tipi sınıflandırıcının doğruluğu eğitim ve test aşamaları için sırasıyla %80,65 ve %75,93 idi. Görüntü kalitesi ve sayısı bu tekniğin başarısı için gereklidir.Görüntü kalitesi ne kadar iyi ve veri hacmi ne kadar yüksekse, tanımlamanın doğruluğu da o kadar iyi. Derin öğrenme, tomogramların karmaşık verilerini daha iyi analiz etmek ve tanımlama performansını artırmak için kullanılabilir. Ayrıca, floresan ve 3D kantitatif faz görüntüleme tanımlanan lenfositlerin fizyolojik rollerinin yolunu araştırmak için kullanılabilir.Bu teknik, geliştirildikten sonra hücre biyolojisi ve biyotıp alanlarında ki araştırmacıların farklı organizmalar içinde belirli ilgi çekici hastalıkları keşfetmelerinin önünü açmıştır. Gerçekten de, özellikle immünolojistler, ilgi nüfusunu tanımlamak için bu yeni teknolojiyi kullanarak yararlanabilir.