Analyse der Epididymal Protein-Synthese und Sekretion

Der Säugetier-Nebenhoden erzeugt eines der komplexesten Intraluminal Flüssigkeiten endokrine Drüse um die Post-Hoden Reifung und Lagerung von Spermien zu unterstützen. Diese Komplexität entsteht aufgrund der kombinierten sekretorischen und absorptive Aktivität der epithelialen Zellen Futter. Hier beschreiben wir die Techniken für die Analyse der epididymal Protein-Synthese und Sekretion durch die Konzentration auf die Modell-Protein-Familie von Dynamin (DNM) Mechanoenzymes; großen GTPasen, die das Potenzial haben, Bi-direktionale Membran Menschenhandel Veranstaltungen zu regulieren. Für die Untersuchung von Protein-Expression in epididymal Gewebe beschreiben wir robuste Methodik für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Zielproteinen in Paraffin-eingebetteten Abschnitten und die spätere Erkennung der räumlichen Verteilung dieser Proteine über Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Wir beschreiben auch optimierte Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von exosom wie Bläschen, bekannt als Epididymosomes, die in der epididymal Lumen zur Teilnahme an interzelluläre Kommunikation mit Reifen Spermien abgegeben werden. Als einen komplementären Ansatz beschreiben wir auch die Immunfluoreszenz-Erkennung von Zielproteinen in einer Zelllinie SV40 verewigt Maus Caput epididymal epithelialen (mECap18). Darüber hinaus diskutieren wir den Nutzen der mECap18 Zelle als geeignete in-vitro- Modell mit, um die Regulierung der epididymal sekretorischen Aktivität zu erkunden. Zu diesem Zweck beschreiben wir die Kultivierung Anforderungen für die Aufrechterhaltung der mECap18-Zell-Linie und der Einsatz von selektiven pharmakologische Hemmung Regimen, die ihre sekretorischen Protein Profil zu beeinflussen können. Letztere werden bewertet ohne weiteres über die Ernte der konditionierten Kulturmedium, Konzentration der sekretierten Proteine über Trichloressigsäure Säure/Aceton Niederschlag und ihre anschließende Analyse über die SDS-PAGE und Immunoblotting. Wir behaupten, dass diese kombinierte Methoden für die Analyse von alternativen epididymal Protein-Targets als Auftakt zur Bestimmung ihrer funktionalen Rolle in spermienreifung und/oder Lagerung eignen.