Analyse av Epididymal proteinsyntese og sekresjon

Pattedyr bitestikkel genererer en av de mest komplekse intraluminal væskene av alle endokrine kjertel for å støtte den nye testicular modning og lagring av spermatozoa. Slik kompleksitet oppstår på grunn av kombinerte sekretoriske og absorberende aktiviteten til fôr epitelceller. Her beskriver vi teknikker for analyse av epididymal proteinsyntese og sekresjon ved å fokusere på modellen protein familien dynamin (DNM) mechanoenzymes; store GTPases som har potensial til å regulere toveis membran menneskehandel hendelser. For studier av protein uttrykk i epididymal vev beskriver vi robust metode for immunofluorescence merking av målet proteiner i parafin-embedded deler og den etterfølgende oppdagelsen av den romlige fordelingen av disse proteinene via immunofluorescence mikroskopi. Vi beskriver også optimalisert metodikk for isolering og karakterisering av exosome som blemmer, kjent som epididymosomes, som utskilles i den epididymal lumen til å delta i intercellulære kommunikasjon med modne sædceller. Som en komplementær tilnærming beskriver vi også immunofluorescence deteksjon av mål proteiner i en SV40-udødeliggjort musen caput epididymal epitel (mECap18) cellen linje. Videre har diskutere vi verktøyet av mECap18 celle linjen som passer i vitro modell med å utforske regulering av epididymal sekretoriske aktivitet. For dette formålet beskriver vi culturing kravene for vedlikehold av mECap18 celle linjen og bruk av selektiv farmakologiske hemming regimer som kan påvirke deres sekretoriske protein profil. Sistnevnte er vurdert lett via høsting av betinget kultur medium, konsentrasjonen av utskilles proteiner via Trekloredikksyre/aceton nedbør og deres påfølgende analyse via SDS-side og immunoblotting. Vi hevder at disse kombinerte metodene er egnet for analyse av alternativ epididymal protein mål som et forspill til å bestemme sin funksjonelle rolle i sperm modning og/eller lagring.