Análise da síntese proteica epidídimo e secreção

O epidídimo mamíferos gera um dos mais complexos fluidos intraluminal de qualquer glândula endócrina para oferecer suporte a maturação pós-testicular e armazenamento de espermatozoides. Tal complexidade surge devido a atividade secretora e absorvente combinada das pilhas epithelial forro. Aqui, descrevemos as técnicas para a análise da secreção e síntese de proteínas epidídimo, centrando-se sobre a família de proteínas de modelo de Dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPases grandes que têm o potencial para regular eventos de tráfico membrana bi-direcional. Para o estudo da expressão da proteína no tecido epidídimo, descrevemos a metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas secções de parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através microscopia de imunofluorescência. Também descrevemos a metodologia otimizada para o isolamento e caracterização de exossomo como vesículas, conhecido como epididymosomes, que são secretadas no lúmen epidídimo para participar na comunicação intercelular com maturação de células de esperma. Como uma abordagem complementar, também descrevemos a detecção de imunofluorescência de proteínas alvo em uma linhagem de células do rato SV40-imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18). Além disso, podemos discutir o utilitário da linha de celular mECap18 como um modelo adequado em vitro com para explorar a regulação da atividade secretora epidídimo. Para este fim, descrevemos as exigências de cultivo para a manutenção da linhagem celular mECap18 e o uso de esquemas de inibição farmacológica seletiva que são capazes de influenciar seu perfil de proteínas secretoras. Os últimos são prontamente avaliaram através da colheita de condicionados de meio de cultura, concentração de proteínas secretadas através de precipitação do ácido tricloroacético/acetona e sua posterior análise através de SDS-PAGE e immunoblotting. Podemos afirmar que esses métodos combinados são apropriados para a análise de alternativas de proteína epidídimo alvos como um prelúdio para determinar seu papel funcional na maturação do esperma e/ou armazenamento.