Анализ эпидидимальных белкового синтеза и секреции

Млекопитающих придатка генерирует один из самых сложных жидкостей внутрипросветная любой эндокринной железы с целью поддержки после яичка созревания и хранения сперматозоидов. Такая сложность возникает из-за совместная деятельность секреторных и освоения накладки эпителиальных клеток. Здесь мы описываем методы для анализа эпидидимальных белкового синтеза и секреции, сосредоточив внимание на модели белков семейства Динамин (ДНМ) mechanoenzymes; большие GTPases, которые имеют потенциал, чтобы регулировать двунаправленным мембраны оборота событий. Для изучения экспрессии белков в эпидидимальных ткани мы описываем надежной методологии Этикетировочный иммунофлуоресценции белков-мишеней в парафин врезанных секций и последующего обнаружения пространственного распределения этих белков через иммунофлуоресценции. Мы также обсудим оптимизированный методологии для изоляции и характеристика exosome как пузырьки, известный как epididymosomes, который выделяется в эпидидимальных люмен участвовать в межклеточные связи с созревания сперматозоидов. Как дополнительный подход мы также описывают иммунофлюоресценции обнаружение целевых белков в увековечен SV40 мыши caput эпидидимальных эпителия (mECap18) клеток линии. Кроме того мы обсуждаем утилита mECap18 клеточной линии как модель подходит в пробирке с для изучения регулирование эпидидимальных секреторную активность. Для этой цели мы описываем культивирования требования для поддержания линии клеток mECap18 и использование селективного фармакологических ингибирование схем, которые способны влиять на их профиль белка секреторных. Они легко оценить через уборки кондиционером питательной среды, концентрация секретируемые белки через трихлоруксусной кислоты/ацетон осадков и их последующего анализа через SDS-PAGE и immunoblotting. Мы утверждаем, что эти комбинированные методы подходят для анализа альтернативных эпидидимальных белковых мишеней в качестве прелюдии к определению их функциональной роли в созревания сперматозоидов и/или хранения.