Yazarlar bu eser destek için Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi, Avustralya proje Grant APP1103176 kabul etmek istiyorum.

Hayvan doku koleksiyonu içeren tüm deneysel prosedürler Newcastle Üniversitesi'nın hayvan bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. ayirt parafin gömülü epididimal bölümlerini (Şekil 1 ve 2) boyama
<ol><li>Hemen sonra ötenazi CO2 inhalasyon (İsviçre fareler, 8 hafta boyunca) ile yetişkin farelerin, dikkatle (cerrahi makas ve cımbız kullanarak) epididim teşrih bağ dokusu ve yağ örten ücretsiz ve Bouin'ın sabitleştirici bırakın Çözüm (> 10 kat...

Bu çalışmalar parafin gömme ve standart parça protokolleri için tabi Bouin'ın sabit epididimal doku kullanımı dahil. Bouin'ın sabitleştirici çözüm özel ve tamamlayıcı bir işleve sahip her bileşeni ile formaldehit, pikrik asit ve asetik asit, karışımından oluşmaktadır. Böylece, formaldehit protein çapraz bağlantıları oluşturmak için Birincil aminler ile reaksiyona girer, pikrik asit tuzları oluşturan doku yavaş yavaş nüfuz eder ve dolayısıyla koagulasyon temel proteinler ve tersine, ...

Sperm hücreleri tüm memeli türlerinin ileri aşamalı hareketliliği görüntülemek için ve bir yumurta sırasında uzun süreli düşüşünü epididim, çok özel bir bölge olabilir erkek ekstra testis kanal sistemi ile döllemek için potansiyel elde 7-14 gün (tür bağlı olarak) gezinmek için1. Baba tarafından kromatin aşırı yoğunlaşma ve testis içinde sperm cytodifferentiation eşlik eden sitoplazma çoğunluğu dökülme nedeniyle, onların sonraki fonksiyonel olgunlaşma sadece onların etkileşim tarafından tahrik edilmektedir epididimden microenvironment ile. Bu ortamın sırayla, astar epididimal soma salgı ve dinsel etkinliği tarafından oluşturulur ve olağanüstü bir parça-parça değişimi1düzeyini görüntüler. Böylece, protein sentezi ve salgı açısından en aktif kesimleri epididimlerden (yani, kaput ve corpus)2proksimal kısmında bulunan bunlar. Bu etkinlik sperm, fonksiyonel yetkinlik işaretlerinden görüntülemek için hücreleri ilk başlangıcı ile fonksiyonel profil aynalar (i.e., asit çözündürüldükten zona glikoproteinlerin için bağlama yeteneği ve ilerici hareket) aşağıdaki onların geçit ile kaput epididim3. Bu işlev öznitelikler sperm boşalma için hazırlık içinde sakin bir durumda neyin saklandıkları distal epididimal kesimi (Kauda), ulaştığı en yüksek düzeyleri ulaşmadan önce geliştirmeye devam. Oluşumu ve bu sperm depolama haznesi bakımından da yakından hangi Kauda güçlü dinsel etkinlik4,5tarafından hakimdir astar epitel bağlıdır. Bildirilen6,7,8anatomik farklılıklar olmasına rağmen işbölümü bölgeselleştirilmiş bu tür memeli türlerin çoğunluğu arasında paylaşılan epididim karakteristik gibi görünüyor kendi9,10da dahil olmak üzere bugüne kadar okudu. Nitekim, klinik bir bakış açısından, bu o epididimal disfonksiyon erkek faktör infertilite11böylece bu özel doku Yönetmeliği anlama önemini vurgulayarak, etiyolojisi için önemli bir katkı yapar bilinmektedir.
Bu nedenle anlayışımız epididimal Fizyoloji ve sperm olgunlaşma ve depolama bu doku içinde sıralı aşamalarını düzenleyen mekanizmalar tam olarak çözümlenmesi için kalmasını üzüntü vericidir. Katkıda bulunan faktörler arasında sınırlayıcı epididimal araştırma gelişmeler bu doku genel karmaşıklığı ve bilgi luminal onun microenvironment üzerinde yasal denetim mekanizmaları vardır. Anatomik olarak, biz ötesinde kaput, corpus ve kauda kesimleri ayrım, epididim daha da çeşitli bölgelere (Şekil 1A) ayrılmıştır, her septa12 tarafından ayrılmış ve gen/protein ayrı profilleri tarafından karakterize olduğunu biliyorum ifade13,14,15,16,17,18. Nitekim, ayrıntılı transkripsiyon epididim segmental gen ifadesinde profilleme temelinde, en çok 6 ve 9 ayrı epididimal bölgeleri fare ve sıçan modellerinde, sırasıyla19,20bildirilmiştir. Bu karmaşıklık muhtemelen epididimal soma, çok sayıda farklı hücre türleri oluşan bir pseudostratified epitel bileşimi yansıtır; her yolu uzunluğu boyunca kendi bereket, dağıtım ve salgı/dinsel faaliyetleri ile ilgili olarak farklı. Böylece, asıl farkla en bol epididimal hücre türü tüm epitel hücrelerinin % 80 yukarı oluşturan hücrelerdir. Buna göre asıl epididimal protein biyosentezi ve salgı5hacim için sorumlu hücrelerdir. Buna ek olarak, epididimal soma içinde ikinci en bol bulunan hücre türü olarak rütbe, Açik Hücre nüfus öncelikle luminal bileşenlerinin seçici emme ve bu microenvironment5asitleştirme katılmaktadırlar. Karmaşıklık başka bir katmanı ekleme, androjenler ve diğer lumicrine faktörler testis kökenli onların yolu konumlandırma bağlı olarak bu epididimal hücre türlerinin her biri üzerinde değişiklik kontrol uygulamayın.
Böyle karmaşıklığı tarafından uygulanan sınırlamaları rağmen epididimal fonksiyonu mekanik temeli çözme içine yapılması önemli yayılmakta devam. Bu çalışmalar için bir anahtar ilk anketler arasından seçilen bireysel proteinlerin ayrıntılı analizler ile tandem epididimal Proteom geniş ölçekli stoklar kurmak için gelişmiş kütle spektrometresi stratejileri uygulanması olmuştur. Mechanoenzymes fare modeli21DNM ailesinin son bizim karakterizasyonu bu yaklaşım örnektir. DNM ilk bizim ilgi exo - ve endocytotic süreçlerin kaplin içinde çift kendi eylem tarafından yakıt. Bu gözlemler üzerinde bina, biz DNM (DNM1 - DNM3) üç kurallı izoformlarının çok fare epididim ifade ve protein salgılanması ve emme21 düzenleyici rolleri yerine getirmek için uygun şekilde konumlandırılmış . Ayrıca, biz böylece tamamlayıcı, epididimal epitel21içinde gereksiz, aktivite karşı sahip oldukları öne açıkça onların hücresel ve alt hücresel yerelleştirme temelinde her DNM izoformu ayırt etmek başardık.
Burada, bu bilgi daha geniş uygulama alternatif epididimal proteinler karakterizasyonu bulmak ve böylece katkıda umut ile fare epididim ifadede DNM çalışma için istihdam deneysel yöntemi açıklamak bizim Erkek üreme sistemi önemli bu öğenin işlevini anlama. Özellikle, biz hedef proteinlerin epididimal bölümlerde parafin gömülü ve bu proteinler ayirt üzerinden kayma dağılımını izleyen tespiti ayirt etiketleme için sağlam metodoloji geliştirilmesi tarif mikroskobu. Biz daha fazla yalıtım ve epididymosomes karakterizasyonu için bizim son zamanlarda en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları22 belge; epididimal salgı profili temel unsurları teşkil ve sperm olgunlaşma23teşvik önemli bir rol tutmak için görünen küçük eksozom benzeri veziküller. Tamamlayıcı bir yaklaşım biz de bir ölümsüzleştirdi fare kaput epididimal epitel (mECap18) hücre kültürünü hedef proteinlerin ayirt algılama ve bu kaynak kullanımı ile düzenleme, epididimal keşfetmek için bir model olarak tarif salgı faaliyet içinde vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynamin 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108458</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamin 2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6400</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamin 3 antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>14737-1-AP</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP6V1B1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-21206</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553758</td>
			<td>Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1180</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALOX15 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80221</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBB antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5274</td>
			<td>Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSMD7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11436</td>
			<td>Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11058</td>
			<td>Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rat Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A11007</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit HRP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DC03L</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rat HRP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DC01L</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Mouse HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#945;-androstan-17&#946;-ol-3-oneC-IIIN</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Astral</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-gysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>78787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A6-2.5 L GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>783-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axio Imager A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>Optima Max-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heracell</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Orbital Shaker</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>OM7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG</td>
			<td>MS3840SR /00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab pH Meter</td>
			<td>MeterLab</td>
			<td>PHM220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid-repellent slide marker</td>
			<td>Daido Sangyo</td>
			<td>Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Mikro-Glass</td>
			<td>SF41296PLMK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter</td>
			<td>Millox-HV</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Dustfree Paper</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 &#215; 35 mm)</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>347356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 &#215; 56 mm)</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>362305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#181;m Nylon</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 &#215; 10 mm with cams</td>
			<td>SARSTED</td>
			<td>82.1135.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide jar</td>
			<td>TRAJAN</td>
			<td>#23 319 00</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of epididymal protein synthesis and secretion

Memeli epididim biri herhangi bir endokrin bezinin en karmaşık intraluminal sıvıların sonrası testis olgunlaşma ve sperm hücreleri depolanmasını desteklemek üzere oluşturur. Bu karmaşıklık kombine salgı ve dinsel etkinliği astar epitel hücreleri nedeniyle ortaya çıkar. Burada, biz dynamin (DNM) mechanoenzymes modeli protein ailesi de odaklanarak epididimal protein sentezi ve salgı analizi için teknikler tarif; Çift yönlü membran kaçakçılığı olayları düzenleyen potansiyeline sahip büyük GTPases. Protein ifade epididimal doku çalışma için biz hedef proteinlerin parafin gömülü bölümlerde ve bu proteinler kayma dağılımını izleyen tespiti ayirt etiketleme için sağlam metodoloji tarif ayirt mikroskobu. Ayrıca izolasyon ve veziküller, sperm hücrelerinin olgunlaşması ile hücreler arası iletişim katılmaya epididimal lümen içine salgılanan epididymosomes olarak bilinen gibi ya karakterizasyonu için en iyi duruma getirilmiş metodoloji açıklar. Tamamlayıcı bir yaklaşım, ayrıca bir fare SV40 ölümsüzleştirilmiş kaput epididimal epitel (mECap18) hücre kültürünü hedef proteinlerin ayirt algılama açıklar. Ayrıca, biz mECap18 hücre satırı yardımcı programı ile, düzenleme, epididimal salgı faaliyet keşfetmek için uygun vitro model olarak tartışıyorlar. Bu amaçla, biz mECap18 hücre kültürünü ve onların salgı protein profil etkileyen özelliği olan seçici farmakolojik inhibisyon rejimlerinin kullanımı için bakım gereksinimleri kodlamayla tanımlamak. Belgili tanımlık ikinci are kolayca şartına kültür orta, salgılanan proteinler trichloroacetic asit/aseton yağış ile konsantrasyon ve onların sonraki analiz SDS-sayfa ve immunoblotting üzerinden hasat ile değerlendirildi. Bu kombine Yöntemler sperm olgunlaşma ve/veya depolama fonksiyonel rollerinin belirlenmesi için bir başlangıç olarak alternatif epididimal protein hedeflerin analizleri için uygun olduğunu iddia.

Resim 1 ve Şekil 2 fare kaput epididim DNM ayirt yerelleştirme temsilcisi sonuçlarını göster. Her biri üç DNM izoformlarının görüntü farklı yerelleştirme profilleri araştırıldı. Böylece, DNM1 ilk segment ve kaput epididimlerden (Şekil 2A) boyunca epididimal hücrelerinin nispeten mütevazı diffüz etiketleme ile karakterizedir. Buna karşılık, DNM2 izoformu il...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion at JoVE.com

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Burada, proteinler parafin gömülü fare epididimal bölümlerde yer tespiti ve bu bir ölümsüzleştirdi epididimal hücre hattı (mECap18) iletişim kuralları göstermek için dynamin ayirt lokalizasyonu raporu. Ayrıca izolasyon epididimal sıvı ve şartına hücre medya salgı proteinlerin protokollerde açıklar.

Epididimal Protein sentezi ve salgı Analizi

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

This combined masters can answer key questions in the field of epididymal research, such as what protein targets are involved in the regulation of sperm maturation and storage. The main advantage of epididymal isolation technique is that it also applicable to isolate a similar population from other regions of epidermis among different species. To begin this procedure, transfer the epididymal paraffin sections to a fume hood.Add enough xylene to the slide jar to completely immerse the tissue section. Rehydrate the tissue sections by immersing them in graded ethynol solutions diluted in purified water as outlined in the text protocol. Wash the sections in a slide jar for five minutes with sufficient PBS to completely immerse the entire tissue section.Next, decant the appropriate antigen retrieval solution into a slide rack. Microwave the solution until it is boiling. Completely immerse the slides in the solution, subjecting the the tissue sections to heat-induced antigen retrieval solutions.After this, remove the slide container from the microwave and let it cool to room temperature. Rinse the slides in a jar containing PBS for five minutes. Using a liquid-repellent slide marker pen, trace around the tissue section.Transfer the slides to a humidified container. Apply blocking solution for one hour at 37 degrees Celsius. Then, rinse the slides once with PBS.Incubate the sections with an appropriate primary antibody diluted to an experimentally-optimized concentration in filtered 1%BSA PBS at four degrees Celsius overnight. After re-warming the slides to room temperature, wash the slides with PBS on a shaking platform at 60 RPM for 10 minutes. Repeat this wash two additional times.Incubate the sections with an appropriate secondary antibody diluted in filtered 1%BSA PBS at 37 degrees Celsius for one hour. From here onward, keep the slides in the dark. Wash the slides three times with PBS on a shaking platform at 60 RPM for 10 minutes per wash.Then, stain, mount and seal the samples as outlined in the text protocol. Immediately after euthanizing the adult mice, profuse their vasculature with PBS that has been pre-warmed to 37 degrees Celsius to minimize the blood contamination of epididymal tissue. Carefully dissect the epididymis free of overlying fat and connective tissue, and rinse with modified BWW medium to reduce any potential for surface blood contamination.Blot the epididymal tissue to remove excess media and dissect the caput epididymis. Then, transfer the dissected caput epididymis to a fresh petri dish containing BWW medium, making sure that the amount of medium is sufficient for the final recovery. Using a razor blade, make a number of small incisions into the caput tissue.Do not mince the tissue. Incubate at 37 degrees Celsius with mild agitation for 30 minutes to release the luminal contents. Using 70 micrometer membranes, filter the resultant suspension and remove the cellular debris.Collect the suspension and subject it to successive centrifugation steps at four degrees Celsius with increasing velocity to eliminate cellular debris. Next, prepare discontinuous iodixanol gradients as outlined in the text protocol. Prepare the gradient in an ultracentrifuge tube using each fraction of 450 microlitres.Visually inspect the gradient after each fraction is applied to ensure that the interfaces are successfully formed between each layer. Carefully add 450 microlitres of epididymal luminal fluid suspension on top of a single gradient. Ultracentrifuge the gradients at 160, 000 times g and four degrees Celsius for 18 hours.Gently remove 12 equal fractions from the centrifuged gradient, starting from the uppermost layer and progressing toward the bottom of the gradient. If applicable, pool the equivalent fractions recovered from each gradient. After fractions nine through 11 have been recovered and pooled, dilute them into two milliliters of PBS.Ultracentrifuge the samples at 100, 000 times g and four degrees Celsius for three hours to pellet the epididymisms. Then, carefully aspirate and discard the supernatant, making sure to not disturb the epididymism pellet. It is essential to assess epididymism purity before any downstream applications.After preparing the sterile coverslips, passage aliquots of 200, 000 mEcap 18 cells in each well of the 12 well plate containing the coverslips. Culture the cells as outlined in the text protocol. Once the cells have adhered to the coverslip, discard the medium and rinse the cells twice with PBS.Add a sufficient amount of 4%paraformaldehyde to immerse the entire coverslip, and fix the cells at room temperature for 15 minutes. Then, discard the paraformaldehyde solution and rinse the coverslips twice in PBS. Immerse the rinsed coverslips in 0.1 Triton X-100 in PBS for 10 minutes to permeabalize the cells.Rinse, block and immunolabel the cells as outlined in the text protocol. First, passage aliquots of mEcap 18 cells into a 6 well plate as outlined in the text protocol. Once adhered, wash the cells three times with FBS-free mEcap 18 cell medium to remove residual FBS and any associated protein contaminants.Then, add 1.5 milliliters of FBS-free mEcap 18 cell medium to each well. Incubate for 12 hours in a 37 degree Celsius incubator under an atmosphere of 5%co2. After this, collect the cell medium and centrifuge at 2, 000 times g for 10 minutes to remove all cellular debris.Using a standard trypan blue exclusion assay, assess the mEcap cell viability. Add 20%volume of chilled 100%trichloroacetic acid to 80%volume of condition cell medium to precipitate the proteins released from the cultured mEcap 18 cells. Incubate at four degrees Celsius overnight with constant mixing.Next, centrifuge at 17, 000 times g and four degrees Celsius for 10 minutes. Discard the supernatant and wash the protein pellet twice with chilled acetone. Then, centrifuge again at 17, 000 times g and four degrees Celsius for 10 minutes.Carefully remove and discard the supernatant once more. Then, air dry the samples in the fume hood to remove any residual acetone. Each of the DNMI isoforms investigated displays a distinct immunofluorescence localization profile.DNMI is characterized by relatively modest diffuse labeling of the epididymal cells throughout the initial segment and caput epididymis. The DNM2 isoform is first detected in the vicinity of the opposing basal and apical border of cells in the initial segment, before repositioning to the supranuclear domain in cells within the adjacent downstream caput segment. The intensity of this labeling gradually decreases between zones two and five of the caput epididymis, which essentially mirrors the secretory activity of these epididymal segments.The supranuclear labeling of DNM2 is subsequently seen to correspond to the distribution of the golgi apparatus within caput principal cells. The DNM3 isoform is mainly detected in the apical domain of a small number of caput epithelial cells, which are seen to correspond to the clear cell subpopulation by co-labeling with the recognized clear cell marker ATP6V1B1. Next, an immortalized mEcap 18 cell line is utilized as an in vitro model to study epididymal cells'secretory activity.The distribution patterns are seen to be consistent with those seen in caput epididymal tissue sections, with DNM1 detected throughout the cytoplasm of mEcap 18 cells, DNM2 concentrated within the supranuclear of these cells, and DNM3 characterized by discrete foci of membrane staining within a small sub-population number. While attempting the immunofluorescence detection, it's important to remember to optimize the conditions for each antigen. The epididymal zone population's isolated are readily amenable for use in downstream applications including co-incubation with spermatozoa and ocalgo per filing analysis both of which are powerful approaches for enhancing our understanding of the role of epididymosome in regulating epididymal sperm maturation.