Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

Hepatócitos são células parenquimais do fígado e envolver várias funções metabólicas, incluindo a síntese e secreção de proteínas essenciais para a homeostase de energia sistêmica. Primários hepatócitos isolados do fígado murino constituem uma valiosa ferramenta biológica para compreender as propriedades funcionais ou alterações que ocorrem no fígado. Neste documento descrevemos um método para o isolamento e a cultura de hepatócitos primários de rato através da realização de uma técnica de perfusão de colagenase em duas fases e discutir a sua utilização para investigar o metabolismo proteico. O fígado de um rato adulto sequencialmente é perfundido com ácido etilenodiaminotetracético de glicol de etileno-bis (EGTA) e colagenase, seguido pelo isolamento dos hepatócitos com o buffer de gradiente de densidade. Estes hepatócitos isolados são viáveis em placas de cultura e mantêm a maioria das características dotadas de hepatócitos. Estes hepatócitos podem ser usados para avaliação do metabolismo de proteínas, incluindo a síntese de proteína nascente com reagentes não-radioativo. Mostramos que os hepatócitos isolados são facilmente controlados e compreendem uma maior estabilidade de volume e qualidade de síntese de proteínas ligada ao metabolismo energético, utilizando a reação de quimio-seletiva da ligadura com uma proteína de diversos (TAMRA) método de detecção e análises de mancha ocidentais. Portanto, esse método é valioso para investigar a síntese hepática da proteína nascente ligado a homeostase de energia. O protocolo seguinte descreve os materiais e métodos para o isolamento dos hepatócitos de rato primária de alta qualidade e detecção de síntese de proteína nascente.