Biz Drs. Joonbae Seo ve Vivian Hwa onların bilimsel girdi ve tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından (NIH) (R01DK107530) destek verdi. T.N. PRESTO Japonya bilim ve teknoloji ajansı tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmanın bir parçası NIH (P30DK078392) sindirim hastalığı araştırma çekirdek merkezi Cincinnati için bir hibe tarafından desteklenmiştir.

Bu iletişim kuralı laboratuvar fareler kullanımını içerir. Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi hayvan bakımı komiteleri tarafından onaylanmış yordamlara göre yapıldı.
1. birincil fare tetkikine yalıtım
<ol><li>Öncesi yalıtım ürünleri<ol>
<li>450 mL % 40 yoğunluk gradient arabelleği Tablo 1 ve tutun 4 ° c (15 mL/fare) açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
		<li>Williams ın orta 500 mL Tablo ...

Her ne kadar birden fazla ölümsüzleştirdi karaciğer hücre satır önerilen ve karaciğer fonksiyonları49,50,51,52araştırmak için kullanılan, bu hücreler genellikle önemli ve temel eksikliği Albümin (Şekil 3) ifadesi gibi normal tetkikine fonksiyonları. Bu yaygın, bu nedenle, birincil tetkikine kullanan karaciğer fizyolojisi ve metabolizma kültü...

Protein önemli bir besin öğesidir ve insan vücudu kuru ağırlığının yaklaşık % 50 birkaç biyolojik özellikleri ve işlevleri1olan proteinlerin oluşmaktadır. Sonuç olarak, protein sentezi en enerji tüketen olaylardan biri ve bir değişiklik protein metabolizması hastalıkları, metabolik hastalıklar2,3,4de dahil olmak üzere gelişimi ile son derece ilişkilidir. Karaciğerde, protein sentezi için toplam enerji tüketimi5,6yaklaşık % 20-30 hesapları. Buna ek olarak, proteinlerin işlevi sadece pasif veya yapı taşları da etkin sinyal arabuluculuk faktörler ama karaciğer intracellularly veya extracellularly sistemik metabolizma7düzenleyecek. Örneğin, sentezlenmiş ve karaciğer ve plazma8en bol protein tarafından salgılanan, serum albümin düşük düzeyde artar tip 2 diyabet gelişimi9,10, riskini 11, oysa serum albümin daha yüksek bir konsantrasyon metabolik sendrom12geliştirme karşı koruyucudur. Ayrıca, rahatsız veya kesintileri kolesterol homeostazı, lipoproteinler, LDLR ve LRP1, gibi modüle salgı veya membran bağlı hepatik proteinler insülin direnci, hiperlipidemi veya ateroskleroz gelişimi için yol açabilir 13. bu nedenle, protein metabolizması bozukluğu karaciğer ve onun ilişkili metabolik komplikasyonlar katılmaktadırlar moleküler patofizyolojik mekanizmaları kimliği roman farmakolojik keşfetmek için yararlı olabilir başlangıçlı geciktirir veya insülin direnci, diyabet ve non alkolik yağlı karaciğer gibi metabolik hastalıkları tedavi etmek için yaklaşıyor.
Protein sentezi sıkıca bağlı hücresel enerji durumuna (Örneğin, bir peptit bağı oluşumu sırasında protein sentezi uzama adım gerektirir 4 fosfodiester bağları14) ve hissediyorum moleküler yolları tarafından düzenlenmiştir Inter - ve Intra-net - cellular besin durumu15,16. AMP-aktive protein kinaz (AMPK) enerji homeostazı17korumak hücre içi enerji sensörler biridir. Hücresel enerji düzeyleri daha düşük olunca AMPK etkinleştirildiğinde, AMPK ve onun hedeflenen yüzeylerde katabolik yolları teşvik etmek ve protein sentezi18,19gibi anabolik işlemlere inhibe işlev. Protein sentezi düzenlenmesi, birden fazla çeviri faktörleri ve ribozomal proteinler20fosforilasyon tarafından aracılık ettiği. Belirtmek gerekirse memeli rapamycin karmaşık 1 (mTORC1), protein sentezi, büyük bir sürücü AMPK21ana hedeflerinden biri hedeftir. MTORC1 aktivasyonu hücre büyümesi ve nükleer silahların yayılmasına karşı uyarıcı protein çeviri autophagy20,ve21tarafından artırır. Bu nedenle, harekete geçirmek-in AMPK mTORC1-aracılı protein sentezi22inhibe olabilir mantıklı olur. Nitekim, AMPK aktivasyonu çözdüğünü ve doğrudan mTORC1 inactivation23 ve protein biyosentezi24bastırılması için önde gelen treonin kalıntı 2446 (Thr2446) üzerinde phosphorylates. Ayrıca, AMPK dolaylı olarak mTORC1 işlev fosforilasyon ve mTORC1 sinyal art arda sıralı akış yukarı regülatör olan Tüberöz skleroz karmaşık 2 (TSC2)25 aktivasyonu tarafından inhibe olabilir. Kısacası, bu yollar karaciğerde bozukluk genellikle metabolik hastalıklar gelişimine bağlı ve bu nedenle çok enerji tür ile bu yollar rolünü araştırmak için etkili deneysel araçları kurmak için kritik bir ihtiyaç ve protein metabolizmasında tetkikine.
İzole birincil tetkikine fonksiyonel özelliklerini ve daha vivo hepatosit karaciğer kaynaklı vitro hücre hatları26,27,28ile arasında daha güçlü bir benzerlik yoktur. İyi farklılaşmış hepatik kanserli hücreleri ve karaciğer fonksiyonlarını araştırmak için yaygın olarak kullanılan, HepG2 hücreler daha az % 48 bağlamında görüntüler, ancak bu birincil insan hepatositlerin % 77 benzerlik Bu karaciğer biyopsi ile paylaşmak gösterilmiştir Gen ifadesinin29Tercihler. Bu nedenle, ölümsüzleştirdi kültür hücreleri, yerine birincil tetkikine kullanımı araştırma hepatik fonksiyon ve Fizyoloji içinde hayati önem taşımaktadır ve yalıtım ve birincil tetkikine kültürünün çeşitli protokolleri mevcuttur özellikle30,31sıçanlar. Sıçan tetkikine hücreleri nispeten daha yüksek bir verim ile yararlı olmakla birlikte, fare tetkikine genetik olarak modüle fareler geniş durumu nedeniyle birçok bilimsel açıdan büyük bir potansiyele sahiptir. Her nasıl, var birkaç teknik sorunlar üzerinden fareler hücresel ve moleküler-temelli değerlendirmeler için sağlıklı ve bol birincil tetkikine yalıtmaya: ilk olarak, kanül ekleme arabellek reaktifleri ile karaciğer sıvı işlemek çok zordur küçük ve ince fare portal ven veya inferior vena kava nedeniyle; İkinci olarak, daha uzun bir manipülasyon zaman hücre izolasyon sırasında azaltma hücre miktar ve kalite olarak neden olabilir; Üçüncüsü, enzimatik olmayan Mekanik ayırma yöntemleri ciddi zarar görmesine neden ve düşük verim uygun izole birincil tetkikine32,33üretmek. 1980'lerde, collagenase perfüzyon tekniği tetkikine hayvanlar34karaciğerleri üzerinden yalıtmak için kullanılmaya başlandı. Bu yöntem collagenase perfüzyon karaciğer35,36,37, infüzyon ile kalsiyum şelatör çözüm38,39, enzimatik sindirim karaciğer dayanır ve Mekanik ayrışma karaciğer parankimi35. İlk adımda, bir fare karaciğer [Ca2 +] şelatör (ethylenediamine tetraacetic asit, EDTA) içeren kalsiyum [Ca2 +] boş bir arabellek ile derin. İkinci adımda, fare karaciğer cep-hücre dışı matriks etkileşimleri hidrolize için collagenase içeren arabellek ile derin. Bir adımda kullanılan arabellek [Ca2 +] İkinci adım arabellek iyonu varlığı etkili collagenase etkinlik, sonra sindirilir karaciğer vardır daha fazla yavaşça ve mekanik arasında forseps kullanarak ayrı kalmak için gereklidir Hepatik kapsül ve parenchymatous doku. Son olarak, bağ dokusu süzerek kaldırılır ve sonraki Santrifüjü hem parenkima olmayan hücrelerden uygun tetkikine ve olmayan yaşam hepatosit ayıran yoğunluk gradient arabellek40,41 kullanımı ile ,42. Bu da çalışmanın, protein sentezi analizi için bir fare karaciğer üzerinden birincil tetkikine yalıtmak için değiştirilmiş iki adım collagenase perfüzyon tekniği gösteriyoruz.
Proteinlerin radiolabeling yaygın ifade düzeyleri, ciro oranları, ölçmek ve proteinler43 radyoaktivite44tespiti yüksek duyarlılık nedeniyle biyolojik dağılımını belirlemek için kullanılır. Ancak, radyoaktif izotoplar kullanımı son derece kontrollü araştırma45şartlar ve yordamlar gerektirir. Alternatif radyoaktif olmayan yöntemler geliştirilmiştir ve giderek popülerlik kazanmıştır. Bir Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein algılama yöntemi ile kemoterapi-seçici ligasyonu reaksiyon onlardan biri ve hücresel olaylar gibi analiz etmek için kullanılan bir azid ve alkin grupları46arasında kemoterapi seçmeli reaksiyon temel alır yeni doğmakta olan protein sentezi ve bir azid grubuyla değiştiren glikoproteinlerin alt sınıflarını tespit. Yeni doğmakta olan protein sentezi için L-Azidohomoalanine (L-AHA, bir azid-modified amino asit) olabilir metabolik olarak proteinler dahil ve TAMRA protein algılama yöntemi47kullanarak algılandı. Bu tahlil birincil fare tetkikine kullanarak, biz yeni doğmakta olan protein sentez hızı sıkıca ATP kullanılabilirliğini üzerinden mitokondrial bağlantılı olduğunu göstermek ve AMPK harekete geçirmek (Şekil 1).
Özet olarak, birincil fare tetkikine kullanımı protein ve enerji metabolizması soruşturma için çok önemli ve doğmakta olan protein sentezi miktarının yolları geliştirme için ilgili fizyolojik rolü anlayışlar kazanmak için değerli ve hepatosit ile ilgili hastalıkların tedavisi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

Hepatosit karaciğer parenkima hücrelerdir ve sentez ve sistemik enerji homeostazı için gerekli proteinlerin salgılanmasını da dahil olmak üzere birden fazla metabolik işlevleri meşgul. Birincil tetkikine fare karaciğer izole fonksiyonel özellikleri veya karaciğerde meydana gelen değişiklikleri anlamak için değerli bir biyolojik araç oluşturmaktadır. Burada bir iki adım collagenase perfüzyon teknik gerçekleştirerek yalıtım ve birincil fare tetkikine kültürü için bir yöntem tanımlamak ve protein metabolizması soruşturma için onların kullanımı tartışmak. Yetişkin bir fare karaciğer sırayla etilen glikol bis tetraacetic asit (EGTA) ve collagenase, hepatositlerin yoğunluk gradient arabelleği ile yalıtım ardından derin. Bu izole tetkikine kültür tabaklarda uygun ve donatılmış tetkikine özelliklerinin çoğunluğu korumak. Bu tetkikine doğmakta olan protein sentezi radyoaktif olmayan reaktifleri ile de dahil olmak üzere protein metabolizmasının değerlendirmeler için kullanılabilir. Biz izole tetkikine kolayca kontrol edilir ve daha yüksek bir kalite ve hacim istikrar enerji metabolizması için kemoterapi-seçici ligasyonu tepki Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein ile kullanarak bağlı protein sentezi oluşturan göstermek algılama Yöntem ve western Blot analizi. Bu nedenle, bu yöntem hepatik doğmakta olan protein sentezi için enerji homeostazı bağlantılı soruşturma için değerlidir. Aşağıdaki iletişim kuralı malzeme ve Yöntemler yüksek kaliteli birincil fare tetkikine yalıtım ve algılama doğmakta olan protein sentezi için özetliyor.

Birincil fare tetkikine yalıtım yaklaşık 20 x 106 toplam hücreleri/fare bir verim içinde sonuçlanır. Histolojik olarak, canlı ve iliştirilmiş birincil tetkikine poligonal görünür veya tipik altıgen şeklinde ile açıkça membranöz sınır 24 h kuluçka (Şekil 2) sonra belirtildiği.
İzole hücrelerdir birincil tetkikine olup olmadığını doğrulamak için albumin prot...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Bu yöntem, obezitede karaciğer enerjisi ve protein biyosentezinin moleküler değişimleri, alkolsüz yağlı karaciğer ve tip iki diyabet ile ilgili çeşitli metabolik hastalık araştırma alanlarındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, fonksiyonel primer fare hepatositlerinin izolasyonu ve radyoaktif olmayan bir etiketleme substratı ile hepatik yeni doğan proteinlerin saptanmasını kolaylaştırmasıdır. Perfüzyon adımı küçük ve ince fare kan damarları nedeniyle öğrenmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir.Karaciğer perfüzyonu için, inferior Vena Cava veya IVC içine sadece sağ renal ven ile çatallanma içine 24 gauge kateter yerleştirin. IVC içindeki kanülün konumunu koruyan kateter iğnesini çıkarın ve konektörü kullanarak perfüzyon tüpüile 24 kalibrelik bir kanül bağlayın. Dört mililitre kalıcı akış hızında sıcak HBSS eksi ile karaciğer perfüzyon başlayın hızlı bir şekilde iç kan drenaj için dalak damar kesme.10 dakika sonra, HBSS 35 mililitre artı dakikada dört mililitre bir akış hızında Kollajenaz Tip X ile desteklenen fare karaciğer perpin, karaciğer boyunca perfusate dağılımını kolaylaştırmak için yaklaşık 10 saniye her birkaç dakikada bir dalak ven kenetleme. Tüm Kollajenaz perfüzyon olduğunda, karaciğer içine kan geri akışını önlemek için pompa durdurmadan önce bir laboratuvar dokusu üzerine karaciğer transferi. Safra kesesi kaldırmak ve yavaşça herhangi bir kan kaldırmak için taze bir laboratuvar dokusu ile karaciğer silmek için forceps kullanın.Taze sıcak HBSS artı Kollajenaz ile desteklenen beş mililitre içeren bir 100 milimetre Petri çanak karaciğer yerleştirin ve yavaşça karaciğer kapsülü kaldırmak için başıboş uçlu forceps kullanın. Parenkimal dokuyu dikkatlice dağıtmak ve Petri kabına 15 mililitre soğuk DMEM eklemek için forceps kullanın. Orta içine artık parankimal hücreleri serbest bırakmak için yavaşça yırtık karaciğer çalkalayın ve hücrelerin geri kalanını elde etmek için çanak soğuk DMEM başka bir 15 mililitre ekleyin.Sonra doku bulamacını 100 mikron hücreli süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Birincil fare hepatositleri izole etmek için, hücreleri santrifüj ile toplayın ve 10 mililitre taze DMEM'de peleti yeniden askıya alın. Yoğunluk gradyan ayırma için %40 yoğunluk gradyan arabelleği üzerinde hücreleri dikkatlice katmanlayarak, santrifüjden sonra hücreleri üst ve orta katmanlardan atın.Tüpün duvarından ölü hücrelerin toplanıp hücreleri yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarmak için William'ın Orta E'sinin 2-3 mililitrelik birincil parenkimal hepatosit peletini yeniden askıya alın. Santrifüjden önce 7-8 mililitre William's E Medium ile hücreleri karıştırın ve peletin büyüklüğüne bağlı olarak 10, 20 veya 30 mililitre taze William's Medium E'de peleti yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, tohum altı kez 10 beşinci hücrelere altı iyi bir tabak için 37 santigrat derece bir 2-3 saatlik kuluçka için.Kuluçka sonunda, ölü ve bekar hücreleri kaldırmak ve bir gecede kuvöze hücreleri dönmek için% 10 Fetal Sığır Serum ve anti-anti ile takviye DMEM ile orta değiştirin. Azide modifiye edilmiş yeni doğan protein etiketlemesi için, 2X reaksiyon tamponunun 50 mikrolitresine 20 ila 40 mikrogram hücre lisat ekleyin. Distile deiyonize su ile 80 mikrolitre hacmi getirin ve beş saniye boyunca protein çözeltisi girdap.Başka bir beş saniyelik girdap için hücrelere bakır sülfat beş mikrolitre ekleyin, reaksiyon tampon bir beş saniye girdap ile beş mikrolitre takip. Üç dakikalık bir kuluçkadan sonra, 10 mikrolitre yeniden oluşturulmuş reaksiyon tamponu ilavesi iki sini hücrelere beş saniyelik bir girdap için ekleyin ve Numuneyi ışıktan korunan çok rotator bir makinede dört derecede 20 dakika döndürün. Rotasyon sonunda, lysate metanol 300 mikrolitre ekleyin, kloroform 75 mikrolitre takip, ve çift distile su 200 mikrolitre.Santrifüj ile etiketli protein toplamak ve pelet taze metanol 250 mikrolitre ekleyin. Girdap sonra, tekrar lysate santrifüj ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir tiftik içermeyen doku ile çıplak pelet kapağı. PAGE analizi için, beta-mercaptoetanol olmadan yükleme tampon 20 mikrolitre kurutulmuş pelet solubilize ve girdap pelet için 10 dakika.Daha sonra, proteini 70 derecelik bir ısı bloğunda 10 dakika ısıtın ve tetrametilodamin tespiti için numuneyi %10 sodyum dodecyl sülfat jeline yükleyin. Daha sonra AHA etiketli yeni doğan proteinlerin hassas niceliği için değişken modlu lazer tarayıcı kullanın. Histolojik olarak, canlı ve bağlı primer hepatositler, 24 saatlik kültürden sonra, tipik olarak çokgen veya altıgen bir şekilde, açıkça özetlenen bir membranöz sınırla görünürler.İzole hücrelerin primer hepatosit olup olmadığını doğrulamak için bu deneyde albumin protein ekspresyonu düzeyleri fare embriyonik fibroblastları, fare hepatoma hücre hattı, izole primer fare hepatositleri ve fare karaciğerlerinde karşılaştırıldı. Primer fare hepatositleri ve fare karaciğerlerinde albumin protein ekspresyonu saptandı, ancak fare embriyonik fibroblastlarında veya hepatoma hücre hattında tespit edilemedi. 10 mikromolar Rotenon ile 4-6 saat boyunca primer hepatosit tedavisi, hepatik AMP-aktive protein kizide artmış fosforilasyon düzeyleri nin invivo gözlenenlere benzer şekilde saptandığı gibi hepatik AMP-aktive protein kizinin sağlam bir indüksiyonunu saptamıştır.Nitekim, 10 mikromolar Rotenon tedavisibeş saat bir kemoseliye ligasyon reaksiyonu sonucu gösterildiği gibi tedavi edilmemiş kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında tedavi edilen primer hepatositlerde yeni doğan protein sentezi üzerinde derin inhibitör etkileri vardı. Bu yordamı çalışırken, gerekli tüm reaktifleri ve ortamları önceden hazırladığını unutmamak gerekir. Bu teknik, hepatik metabolik patofizyoloji alanında araştırmacının obezitede enerji proteinregülasyonunun moleküler mekanizmasını ve izole primer fare hepatositte tip iki diyabeti keşfetmesinin yolunu açmıştır.