ברצוננו להודות הערות מסוקרים בעילום שם שני חברים טוב של המעבדה פולן לדיון תובנה על התפתחות החיישן אנאירובית. פרס חוקר מוקדם לבין מחוז אונטריו מענק גילוי, תוספת מאיץ מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה כדי A.J.P. מימנה את המחקר הזה.

המחברים אין לחשוף.

חיידקים ביולוגיים הם כלים שימושיים לזיהוי המנגנונים שבאמצעותו מתכות אינטראקציה עם החיידקים. כאן, אנו מתארים שיטה שבה ניתן לכמת anaerobically Hg הזמינות הביולוגיתII II ו- Cd התא המארח גראם שליליים (e. coli), לתת תוצאה הניתנת לכימות תוך מספר שעות. אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול זה הוא שזה מאפשר שליטה מקיף על היווצרות המינים מתכת במדיום חשיפה על ידי הימנעות ליגנדים הנחשב חזק או רכיבים שעלולות להוביל משקעים מתכת. היווצרות המינים מתכת יש כבר וניסו ונבדק במדיום הזה חשיפה באמצעות PHREEQC17, אולם ניתן לפרוס תוכנה היווצרות המינים מתכת אחרת. במקרה של אין ליגנדים הוסיף, Hg היווצרות המינים צפוי להיות נוכח כ 97% Hg(OH)2 ו- 3% Hg (NH3)22 +, בעוד Cd היווצרות המינים יהיה להציג בתור 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +ו- 16% CdSO4. באמצעות תוכנה פשוטה הדוגמנות תרמודינמי, המשתמש יכול לעצב חשיפה בתקשורת, לבדוק הזמינות הביולוגית של המתכת של עניין. בנוסף, התא המארח ביוסנסור (e. coli NEB5α) הוא בר קיימא על מגוון רחב של pH (5-8.5) וריכוז NaCl (0-0.55 מ')17.
Hg מתילציה היא תהליך אנארובי, פרוטוקול המתוארים במחקר זה אין דרישה עבור חמצן, המאפשרות תיאור מדויק יותר של מטבוליזם אנארובי על הזמינות הביולוגית מתכת. זה חשוב כי הנוכחות של חמצן משתנה ג'ין ביטוי פרופילים48,49 , לפיכך, פוטנציאל הובלה מסלולים; לכן שיטה זו מציגה יתרון על פני כעת exising חלופות אירובי. הבונה biosensing המובאת כאן פוטנציאל ניתן להשתמש עם מארחים אנאירובית אחרים שעשויים להיות רלוונטיים יותר עבור מתילציה כספית (למשל, Geobacter, Desulfovibrio), אבל אולי פחות צייתן יותר e. coli. מגבלה אחת הנוכחי של הגישה המובאת כאן היא כי הגבול שלנו של זיהוי לא הגיע עדיין pM רמות, בניגוד קיימות מערכות אירובית4,19,37. . זה חשוב עם זאת לציין כי כדי להשיג את מגבלות אלה נמוך זיהוי מספר שלבים צריכים להילקח44: אני) תוספת ליגנד נדרש כדי להבטיח Hg נשאר בפתרון לא לספוח על גבי קיר התא מיקרוביאלית (Hg יהיה בלתי הפיך מאוגד לתא השטח תיולים מניעת שלה25,הזמינות הביולוגית27; ראה סף התגובה Hg ב איור 3A), ii) שינויים צפיפות התאים, או השלישי) לשנות הבונה גנטית כדי לכלול חלבונים התחבורה של מר-אופרון (כלומר עופר יעקב ו- merP), הגדלת Hg השטף בתוך50,התא51. שינויים אלה יהיה מועיל באיתור ריכוזים נמוכים של כספית, אך לא בהכרח אידיאלי בעת הערכת מצבים הרלוונטיים לסביבה. ואילו הקודם קדמיום ביולוגיים קיימים בעיקר בתור "הוכחה על עקרון", הם תוכננו בתקשורת מורכבות שאינן מאפשרות את החוקר להעריך את התפקיד של היווצרות המינים על הזמינות הביולוגית41,42, 43 , 44.
החיישן הוא כלי שימושי ביותר בקביעת מנגנון שבו הם מינים מתכת bioavailable. מכיוון האורגניזם המארח אינה Hg-methylator, אותו ניתן להשתמש רק לפתח מודל איך Hg עשוי להכניס חיידקים גראם שליליים ואת לא תירוץ סופית איך Hg-methylators לרכוש Hg. שיטות אחרות קיימות עבור קביעת הזמינות הביולוגית כספית, כגון מתילציה, תוצאה של ספיגת או השימוש מאזן מסה הגישה10,15,20,45,46. זאת, השיטה המובאת כאן מציע את היתרון של נתונים בזמן אמת בדאנטה הזמינות הביולוגית התאים קיימא. אנו ממליצים כי בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לכמת את רמות כספית או תקליטור הכולל במטריצה הסביבה. למרות השימוש המוצע ביולוגיים לקביעת ריכוזים מתכת ב סביבה36, רבים בשיטות הרגילות זמינים יותר זמינים כגון ICP-MS, FAAS (לניתוח Cd) או גבס ספקטרוסקופיית בליעה אטומית (עבור Hg ניתוח). עם זאת ניתן החיישן משמש כדי לקבוע אם נתונה מטריצה סביבתיים יש הפוטנציאל לשיפור או ה"בלתי הזמינות הביולוגית; זו מושגת על ידי ביצוע תוספות סטנדרטי.
ה-pH של התקשורת חשיפה עשויה להשתנות כדי בכל מקום בטווח של 5 ו- 8.5, בתנאי החומצה חינם מגבים (מאגר) מוחלף עם חומצה חינם חלופי של מאגר עם pKa המתאים (ראה רשימת מאגרים המתאים (פרירה. et al. (2015) 47), מותאם עם קו ה-pH מתאים בעת ביצוע החשיפה לתקשורת. בנוסף, השיטה אינה מוגבלת Hg ו- Cd, אך יכול להרחיב עליו מתכות אחרות באמצעות אחרים שעתוק regulators.
ניתן לשנות את הבדיקה חשיפה לחקור את ההשפעה של אחרים acceptors אלקטרונים כגון O2 ו- fumarate הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור. שינויים מזעריים השיטה לנצל O2 והן fumarate כמו אלקטרונים acceptors הינם זמינים על פי בקשה.
לסיכום, ברצוננו להדגיש את הנקודות הבאות: אני) זה הכרחי כי הריכוזים של מניות תקליטור או כספית ידועים בשלב 2, כמו אלה ישמש כדי לכייל את החיישן. II) ביום חשיפה, חייבים לעצור את הצמיחה של תאים-OD600 של 0.6 (± 0.1), כי הטיפול נלקח בעת resuspending של תרביות תאים, כמו החיישן מכויל לדחיסות התא הזה. III) לבסוף, חשוב כי המדיום חשיפה מורכב בקפידה יום חשיפה. כדי להבטיח ההצלחה של הפרוטוקול, צריך לגדול תרבויות רבות בעת ובעונה אחת (כדי לעקוף את האפשרות של כשל הצמיחה), מדיום הגידול צריך להיות הניקל שבועי (כדי לעקוף את metastability של התקשורת ושל זיהום אפשרי). יש גם לציין כי ביולוגי משכפל (תרביות תאים מרובים) מביעים השתנות כשמדובר אות הייצור. למרות התגובות פלורסנט עשויים להשתנות מתרבות לתרבות, המגמות פלורסנט בתגובה נתון משתנה צריכים להישאר דומה בכל משכפל ביולוגיים רבים.

מרקורי (Hg) הוא גורם מזהם הכללית והוא הזמינות הביולוגית שלה כדי Hg methylating חיידקים הצעד הראשון לקראת שלה biomagnification דרך במארג המזון, תופעות אפשריות העצבים-אנוש והאטרקציות חיות בר1. כיום היא נחשבת מתילציה Hg מיקרוביאלי הזה הוא תהליך תאיים דורש: i) המינים של כספית להיות bioavailable2,3,4,5,6,7 ו- ii) עבור התא להיות מסוגל מבחינה פיזיולוגית methylating Hg8,9,10. קדמיום (Cd) bioaccumulates של אורגניזמים, אבל עושה לא biomagnifies ב foodwebs, נעשה שימוש נרחב בתהליכים תעשייתיים ומסחריים הגורמות בדרך כלל חשיפות חמור והאנשים סביבה11. למרות חיידקים לשחק בתפקידי מפתח במספר בגורלו של כספית בסביבה, רוב המחקרים על תקליטור גאוכימיה ו ecotoxicology מתמקדים פרוקריוטים מיקרוביאלי12. הצריכה של גידולים חקלאיים (למשל, אורז) היא המקור העיקרי של חשיפה ישירה קדמיום; במקרה זה, הביולוגית של תקליטור כדי חיידקים של rhizosphere משפיעה ישירות על הכמות הצמחים יכול להצטבר13.
Hg התעבורה מסלולים מורכבים, ייתכן כרוכים שלב14של הובלה פעילה. כאשר נהג מעורב עבודה הציע כי HgII משתמשת Znהשנייה או MnII טרנספורטר7,15,16,17. ואילו CdII המשוערות להיות מועבר בטעות לתוך ציטוזול דרך מסלולים כלט תחבורה מתכת (במיוחד MnII או ZnII), מנגנונים של תקליטורII תחבורה בתוך התאים נשארים מסלול התחבורה ספקולטיבי, לא ספציפיים Cd כבר מזוהה13,18. ללא קשר לאופי למעליות מעורב, שלושה גורמים מכניסטית ובסופו של דבר לקבוע את היכולת של מתכות להזין תא: i) היווצרות המינים מתכת פתרון2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) המאפיינים biophysiochemical של קרום התא17,24,25,26,27,28,29 30, ,31, ו- iii) היכולת של המתכת לגשת בגודל7,אתר התחבורה32. Cd / Hg סביר קיים יונים חופשיים בתנאים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מיקרוביאלי בשל זיקתם גבוהה עבור מומס אורגני משנה (DOM), chelating מזהמים (למשל, EDTA), או מופחת גופרית moieties33, 34,35 (Cdהשנייה יכולה להתקיים חינם טופס או יון יון-זוגות בהיעדר אלה ליגנדים). יש חוסר השיטה היעילה בקביעת כמה מינים מתכת אלה הם bioavailable תחת תנאים רלוונטיים לגורלם בסביבה. למשל, כספית הוא מפוגל תחת תנאים אנאירוביים14, קדמיום והן Hg מתכות רכות (או קטיונים B class), המחייב את היווצרות המינים ייחקרו בתנאים לשמור על היושרה של קבוצות תכולה מופחתת של גופרית.
חיידקים ביולוגיים הם תאים חיידקיים הפולטות אות הניתנת לכימות בתגובה ריכוזי מתכת, התיק כספית או תקליטור זו תאיים. בתור שכזה, הם כלי אידיאלי כדי להבין כיצד מתכות להזין תא36, ובלבד חשיפה תנאים נשלטים בקפידה עבור... Hg ביולוגיים כוללים בדרך כלל ג'ין fusions בין המעגלים הרגולציה של מר-אופרון (כולל גנים קידוד עבור הרגולטורים שעתוק MerRas כמו האופרטור ועל יזם מחוזות אופרון) ודיווח על הגנים (למשל, . לאקס, ה-gfp, lac גנים). כאשר מרקורי קיים בציטופלסמה, זה יהיה לאגד עליזה משחק, וכתוצאה מכך שעתוק של גנים דיווח, האותות עוקבות-הייצור-19,-37. ביולוגיים תקליטורים מסוימים מיועדים בדרך כלל באמצעות את cadC, cadAC, zntA או zntR מקודד שעתוק regulators38, אך ראוי לציין כי עליזה משחק יש זיקה נמוכה יותר, עדיין לכימות תקליטור5. עקב מגבלת אירובי של רוב נפוץ כתב מאיר עיניים או פלורסנט חלבונים, עד לאחרונה מיקרוביאלי ביולוגיים נותרה אפשרות להציע תובנות ביואמסה של מתכות בתנאים אנאוקסיים. זה מאפשר אנאירובית איתור מתכות הזמינות הביולוגית קשה מאוד על טווח של תנאים רלוונטיים לגורלם סביבתיים, במיוחד בנוכחות חמצון-חיזור ליגנדים רגיש (למשל, סולפיד ו תיולים)4, 5 , 39.
כדי להקל המשוכה מתודולוגי של לחיות הדמיה, בהעדר חמצן, Drepper. et al. (2007) יש שפותחה חלבון פלואורסצנטי מבוסס פלווין (FbFp), המבוססת על תחום מתח החמצן אור של חלבון SB2 מ- putida פ. המשפחה חלבון הוא מסוגל לזרוח בהיעדר חמצן40. בונים על עבודתו של. Drepper et al., המעבדה שלנו תוכנן של ביוסנסור אנאירובית המאפשר לימוד Hg הזמינות הביולוגית בתנאים oxic, אנאוקסיים, מגוון רחב של מליחות 17. בעיתון הנוכחי, אנו נתאר כיצד להכין ולהשתמש את החיישן לבחון את ההשפעה של משתנים סביבתיים על הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור. למרות שפיתחנו את החיישן עבור HgII, בחרנו לבצע ניסויים עם הדיסקהשני כאמצעי למשוך תשומת לב הקורא לעובדה כי ביולוגיים עשויים להגיב גם במספר לחצים שעלולים להתרחש פעולה סביבתית מטריצות; במקרה זה בתקליטורהשני נחקר כי זה ידוע כדי לאגד הרגולטור תעתיק עליזה משחק5. כאן, אנו מראים כיול נציג וטווחים ליניארי פונקציונלי ביחס או מתכת. אנחנו גם נותנים דוגמא כאשר תוצאות החיישן חותכות (מ גII ו- MnII ב- Hg הזמינות הביולוגית) ולא חד משמעיות (ZnII ב- Hg הזמינות הביולוגית).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

הזמינות הביולוגית כספית (Hg) כדי חיידקים נמצא צעד מפתח רעילים biomagnification Hg ב במארג המזון. הסכום יצטברו בגידולים מזון בסיסי המרות קדמיום (Cd) ובקרת הזמינות הביולוגית חיידקים. הביולוגית של מתכות אלה תלויה שלהם היווצרות המינים פתרון, אלא יותר במיוחד תחת תנאים אנאוקסיים Hg הוא מפוגל כדי רעילים monomethylmercury (MeHg) ואיפה Cd נמשכת ב rhizosphere. כל תאים ביולוגיים מיקרוביאלי לתת אות הניתנת לכימות כאשר מתכת מזין את ציטוזול, לפיכך הן כלים שימושיים כדי להעריך את הזמינות הביולוגית מתכת. למרבה הצער, רוב המאמצים biosensing יש עד כה היה מוגבל ל סביבות oxic בשל היכולת המוגבלת של חלבונים קיימים כתב לתפקד בהיעדר חמצן. במחקר זה, אנו מציגים שלנו מאמץ לפתח, לייעל assay ביוסנסור תאים שלמים מסוגל לתפקד anaerobically זה יכול לזהות מתכות בתנאי אנאוקסיים בזמן אמיתי ומעין, בתוך שעות. אנו מתארים איך החיישן יכולה לעזור להעריך את הרלוונטיות הסביבה רכיבה על אופניים של מתכות משפיעים על הזמינות הביולוגית שלהם איך כימי משתנים. להלן כללי התנהגות כולל שיטות (1) להכנת Hg, תקליטור תקני בתנאים אנאוקסיים, (2) להכין את החיישן בהעדר חמצן, (3) תכנון וביצוע ניסוי כדי לקבוע כיצד סדרה של משתנה משפיע על הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור, ו- (4) כדי לכמת לפרש ביוסנסור נתונים. הצג טווחים ליניארי של ביולוגיים ואנו מספקים דוגמאות מראה של השיטה היכולת להבחין בין הזמינות הביולוגית מתכות רעילות על ידי ניצול מתכת-inducible והן מכוננת זנים.

ברגע יש כבר לכמת את הפסגות זריחה על פי שלב 5.3, התוצאה של הפסגות פלורסצנטיות יכול להיות בגרף לפי הריכוז משתנה הממחישות כיצד אותו משתנה משפיע הביולוגית היחסי של כספית או תקליטור. לדוגמה, עקומת כיול של זריחה מעל [HgII] איור 2 תניב מהנתונים inducible המוצגים באיור 3 א. עבור HgII כיול, הרצון עקומת תמיד מכילים 3 מרכיבי המתח Hg-inducible; תגובה הסף של 1-2 ננומטר Hgהשני לפני זריחה אות ייצור הוא יחסי בצורה לינארית [HgII], הטווח. ליניארית איפה 5 nM HgII יהיה אמין תמיד במרכז הטווח, מישור לאן הגדלת [HgII] כבר לא יגדל פלורסצנטיות אות. אין שינוי בייצור אות על המתח מכוננת מראה כי רעילות מתרופות [HgII] אינה משפיעה על ייצור אות. עבור תקליטורII ב- 3B איור, תמיד יש 2 מרכיבי המתח inducible; מגוון ליניארי שבו בצורה אמינה תמיד יהיה 200-300 ננומטר CdII במרכז הטווח. ליניארית, מישור. ירידה ברמת קרינה פלואורסצנטית האות עם הגדלת [תקליטורII] מראים כי ריכוז גבוה של תקליטור רעילים לתאים יכול להסביר ירידה בייצור פלורסצנטיות inducible לאחר הרמה ב- nM 1000 CdII. לכן, בעת בדיקת הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור ביחס משתנה הסביבה, אנו ממליצים להשתמש 5 nM עבור HgII , 300 ננומטר עבור תקליטורII.
במקרים מסוימים, האות הייצור ניתן כראוי לייחס הזמינות הביולוגית כספית או תקליטור, אך במקרים אחרים, אות הייצור עשויה להיות מושפעת וריאציה במצב פיזיולוגי של המארח תא ביוסנסור (למשל, המתכת של ריבית או תנאים סביבתיים נבדק רעילים). ב- איור 4A, 5 nM Hg הזמינות הביולוגית נבדקה על שיפוע של Zn (0-10 מיקרומטר). Hg-inducible והן זנים מכוננת, יש ירידה דומה האות עם הגדלת Zn ריכוזים. לכן, אחד לא יכול להפלות בין אם האות נובעת הזמינות הביולוגית הוריד או היא תוצאה של Zn רעילות. איור 4B ו- 4 C, 5nM Hg הזמינות הביולוגית נבדקה על מעבר הדרגתי של מ גII (0-10 מ מ) ו- MnII (0-10 מיקרומטר). הגדלת מ גII ו- Mn ריכוזיםהשני ירד האות זריחה של המתח inducible. מצד שני, המתח המכונן לא הראה ירידה זריחה עם הגדלת Mg ריכוזיםII II ו- Mn (מ גII ו- MnII מועילים עבור התאים בייצור של FbFp, כפי שמתואר על ידי גידול בתוך האות קרינה פלואורסצנטית). מדגים כי התאים הם קיימא, הירידה זריחה של המתח Hg-inducible נובעת ירידה Hg הזמינות הביולוגית. נתונים אלה מדגישה עד כמה חשוב עבור כל מבחני ביוסנסור גם לספק מדידות המכונן של כושר תא.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> איור 3: ליניארי טווחי החיישן עם כספית וקדמיום. קרינה פלואורסצנטית המרבי הנמדדת פלורסצנטיות יחסית יחידות (RFU) ± סטיית תקן 1 הנפלטים על ידי e. coli NEB5α מסתירים את pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) ו- pUC19Balch-Pp (Constitutive) עם התוספת של א) HgII (0-15 ננומטר) ו B) CdII (0-1, 000 ננומטר) בתנאים אנאירוביים. קרינה פלואורסצנטית היה שהממוצע של 3 טכני משכפל-הלעפה תרוטרפמט 37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> איור 4: דוגמה של תוצאה חד משמעיות עם אבץ, תוצאה חד משמעי עם מגנזיום והן מנגן. קרינה פלואורסצנטית המרבי הנמדדת פלורסצנטיות יחסית יחידות (RFU) ± סטיית תקן 1 הנפלטים על ידי e. coli NEB5α מסתירים את pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) ו- pUC19Balch-Pp (Constitutive) עם התוספת של א) ZnII (0-10 מיקרומטר), B) מ"גII (0-10 מ מ), ו- C) MnII (0-10 מיקרומטר) בתנאים אנאירוביים. [HgII] נקבע ל-5 ננומטר על כל טיפולי קרינה פלואורסצנטית היה הממוצע של משכפל טכני 3-37 הלעפה תרוטרפמט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש ביוסנסור חיידקים אנאירוביים של תאים שלמים כדי להעריך כמה שונה משתנים סביבתיים משפיעים על הביולוגית של Hg ו- Cd חיידקים בסביבות אנאוקסיים.

Assay ביוסנסור אנאירובית איתור כספית, קדמיום

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי רכיבה על אופניים ביו-גכימיים של קדמיום וכספית כגון כיצד משתנים סביבתיים שונים משפיעים על הזמינות הביולוגית שלהם לחיידקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציעה נתונים מעין הזמינות הביולוגית בזמן אמת ותאים קיימא ללא קשר לנוכחות של חמצן. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי ישנם צעדים רגישים לזמן רב הדורשים תשומת לב קפדנית מאוד לפרטים.להדגים את ההליך יהיה בן, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתכונן לתדהמה, לאחזר את biosensor הכספית בלתי ניתנת לעיכול ואת biosensor מבוטא באופן מכפורי ממניה קריו מינוס 80 מעלות צלזיוס. צלחת התאים על צלחות מרק Lysogeny המכיל 120 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין.לגדל את תרבות הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה. בין 4:30 ו 5 p.m. לחסן תרבות בעשרה מיליליטר של LB עם אמפיצילין לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 220 סל"ד.בין תשע לעשר בבוקר.m הבא להביא את התרבות, כמו גם את מדיום הצמיחה שהוכן בעבר לתוך התא אנאירובי. לאחר מכן הוסיפו שמונה מיליליטר של מדיום צמיחה טרי ו-210 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין לצינור בלך סטרילי.עכשיו לאסוף שני מיליליטר של תרבות לילה גדל ולהעביר לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר. לאחר צנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך 90 שניות, להסיר את supernatant ו resuspend בשני מיליליטר של מדיום צמיחה טרי. לאחר מכן מוסיפים את התרבות המתווסכלת לצינור הבלך המכיל שמונה מיליליטר של מדיום צמיחה טרי ואמפיצילין.באמצעות טכניקה סטרילית, בזהירות למקם פקק גומי על צינור בלך לפני הסרתו מן התא אנאירובי. ואז למקם את הצינור לתוך אינקובטור לגדול אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 220 סל"ד. בין שלוש לחמש אחה.m.להביא את צינור הבלך עם התרבות, צינור בלך סטרילי חדש, ואת מדיום הצמיחה לתוך התא אנאירובי. הוסף 100 microliters של התרבות ל 10 מיליליטר של מדיום צמיחה טרי עם אמפיצילין בצינור בלך סטרילי. בעזרת טכניקה סטרילית, מניחים בזהירות פקק גומי על צינור הבלך.מוציאים את הצינור מהתא האנירובי לפני שמגדלים אותו בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-220 סל"ד. בין תשע לעשר בבוקר.m למחרת, להעביר את התרבות ואת מדיום הצמיחה בחזרה לתא אנאירובי.שוב להוסיף שמונה מיליליטר של צמיחה בינונית ואמפיצילין לתוך צינור בלך סטרילי. מעבירים שני מיליליטר של התרבות הגדלה בן הלילה לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר. לאחר צנטריפוגה כמו קודם, להסיר את supernatant ולתלות את התאים בשני מיליליטר של מדיום צמיחה טרי.לאחר מכן מוסיפים את התרבות המתווסכלת לצינור הבלך המכיל את מדיום הצמיחה הטרי ואמפיצילין. בעזרת טכניקה סטרילית, מניחים בזהירות פקק גומי על צינור הבלך. מוציאים אותו מהתא וגדלים באופן אנאירובי ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-220 סל"ד.לפקח על הצמיחה של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי מערבולת התרבות ולאחר מכן מדידת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר או OD600. לאחר שלוש עד ארבע שעות של צמיחה צפויה, התרבות צריכה להגיע OD600 של 6. עכשיו להביא את הצינור בתא אנאירובי ולהעביר את התרבות לשני צינורות מיקרו צנטריפוגה מיקרו מיליליטר.לאחר צנטריפוגה כמו קודם להסיר את supernatant ו resuspend כל חיך התא בשני מיליליטר של מדיום חשיפה טרי. חזור על שלב כביסה זה פעם אחת כדי להסיר כל זכר של מדיום הצמיחה. עכשיו לשלב את שני צינורות מיקרו צנטריפוגה של תרבות התא לתוך בקבוקון תקן PTFE שבעה מיליליטר כדי להשיג את מלאי biosensor לשימוש בהשגחה חשיפה.לפני תחילת הניסוי לבדוק את הצג אנאירובי כדי להבטיח כי אין חמצן בתא אנאירובי. עצב את פריסת הלוח בהתאם לתבנית באר 96. כדי להריץ ניסויים בשכפולים טכניים של שלושה זה יאפשר 32 טיפולים שונים, אשר מיוצג בצורה הטובה ביותר עם רשת ארבע על שמונה כדי להגדיר את הבקבוקונים.הגדר את רשת ארבע על שמונה בהתאם לפריסה של לוחית ההתנסויות. לאחר מכן מניחים שבעה בקבוקונים סטנדרטיים PTFE מיליליטר במגש. בקבוקונים צריכים להיות מטופלים רק על ידי מניפולציה החלק החיצוני של הבקבוקון.מוסיפים את החשיפה לנפח בינוני לכל בקבוקון המתאים לכל טיפול. לכל בקבוקון להוסיף את הנפח המתאים של המשתנה הכימי להיבדק על פי פריסת הלוח. עכשיו להוסיף חנקתי לכל בקבוקון, כך הריכוז הוא 200 מיקרומולר.אל תכלול שלב זה עבור ריקים טיפול biosensor מכוננים. כדי להוסיף כספית לבקבוקונים, תחילה לקחת את ארבעת עד שמונה מלאי micromolar ולנער היטב. לדלל את הפתרון ואת המדיום חשיפה בבקבוקון PTFE שבעה מיליליטר לריכוז של 100 כדי 250 nanomolar כדי להפוך פתרון כספית עובד.מפתרון עבודה זה, הוסף כספית לבקבוקונים הנדרשים בהתאם למערך הלוח. לאחר הוספת הכספית או קדמיום ידני לנער את הצלחת בתנועה מסלולית. הניסוי עשוי להיות מושהה עכשיו בהתאם לזמן הנדרש עבור כספית או קדמיום כדי speciate בפתרון.כאשר הניסוי מתחדש, בעדינות פימט biosensor מלאי הלוך ושוב כדי להבטיח הומוגניות. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מלאי הביו-סנסור לכל בקבוקון ונערו ידנית את הצלחת כבעבר. לחמם את קורא הלוח ל 37 מעלות צלזיוס ולהגדיר ריצה קינטית במשך עשר שעות עם קריאות כל שתי נקודות חמש עד חמש דקות.מסלול רועד בין הקריאות. הגדר את הריצה לקחת מדידות פלואורסצנטיות עם גירוי פלואורסצנטי של 440 ננומטר ו פליטה של 500 ננומטר. עכשיו פיפטה 200 microliters מכל בקבוקון PTFE ברשת ארבע על שמונה לתוך בארות המתאימות של צלחת 96 באר.פיפטה הלוך ושוב חמש פעמים לפני העברת כל 200 מיקרוליטר. במקום להשליך את קצה פיפטה, להשאיר את קצה פיפטה בבקבוקון PTFE כדי לעקוב אחר התקדמות pipetting. מניחים את צלחת 96 היטב לתוך המגש של קורא הלוח.לאחר מכן מניחים את המכסה על צלחת 96 היטב ולהתחיל את הראיה. להלן תוצאות מייצגות המציגות נתוני פלואורסצנטיות מתוקנים כפונקציה של זמן. פלואורסצנטיות מוצגת עם ריכוזים הולכים וגדלים של כספית לביוסנסור הבלתי ניתן לעיכול.כל הערכים ריקים לפקד ללא כספית. ניתן לכמת את הפסגות הפלואורסצנטיות כדי להראות את האות הפלואורסצנטי כפונקציה של ריכוז כספית או קדמיום. הן עבור biosensors בלתי ניתן לעיכול והן עבור biosensors מכווני, ריכוז כספית או קדמיום באמצע הטווח ליניארי חיישנים בלתי ניתנים לעיכול יש להשתמש לבדיקת משתנים.להלן דוגמאות לתוצאה לא חד משמעית עם אבץ. ותוצאה חד משמעית עם מגנזיום ומנגן על הזמינות הביולוגית של כספית לביוסנסור. התוצאה עם אבץ אינה חד משמעית מכיוון שהנוהורסצנטיות המכוננית נרקבת עם פלואורסצנטיות בלתי ניתנת לחיסון המצביעה על רעילות.בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להזין את הריכוזים של קדמיום או כספית כמו אלה ישמשו כדי לכייל את biosensor. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מידול תרמודינמי של מערכות מים כדי לענות על שאלות נוספות כגון כיצד מינים כימיים ספציפיים של כספית או קדמיום משפיעים על הזמינות הביולוגית שלהם. אל תשכח כי עבודה עם קדמיום וכספית וחומצות חזקות כגון חומצה גופרתית יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה הסביבתית לחקור את הזמינות הביולוגית האנ אירובית או קדמיום בזמן אמת ואת המיקרואורגניזמים הניתנים להגנה גנטית.

Assay ביוסנסור אנאירובית איתור כספית, קדמיום

Abstract