المؤلف يود أن يشكر أعضاء المختبر روجرز ومختبر أبليوهيتي، غريتا غلوفر، والطلبة في كلية ريد في ربيع عام 2018 "البيولوجيا الخلوية" الحال، الذين ساهموا في وضع هذا البروتوكول. علاوة على ذلك، المؤلف يود أن يشكر أعضاء المختبر ريتز لقراءة وتحرير هذه المخطوطة بعناية. وأيد "المؤسسة الوطنية للعلوم" تحت رقم جائزة 716964 D.A.A. وا. ر. وقسم الأحياء كلية ريد البحث عنها في هذا المنشور.

<ol>
	<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyBase+portals+to+human+disease+research+using+Drosophila+models.">FlyBase portals to human disease research using Drosophila models.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).</li><li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high-throughput+RNA+interference+screens+to+problems+in+cell+and+developmental+biology.">Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology.</a> Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).</li><li>Currie, J. D., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Drosophila+melanogaster+D17-c3+cell+culture+system+to+study+cell+motility.">Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).</li><li>Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+Cytoskeleton+Using+Live+and+Fixed+Drosophila+Tissue+Culture+Cells.">Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells.</a> Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).</li><li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+requirements+for+actin-based+lamella+formation+in+Drosophila+S2+cells.">Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).</li><li>Yi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+reveals+multiple+regulators+of+caspase+activation.">A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).</li><li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection.">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).</li><li>Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inference+of+RhoGAP/GTPase+regulation+using+single-cell+morphological+data+from+a+combinatorial+RNAi+screen.">Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen.</a> Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).</li><li>Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+epithelial+morphogenesis+by+the+G+protein-coupled+receptor+mist+and+its+ligand+fog.">Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog.</a> Science Signaling. 6 (301), 98 (2013).</li><li>Leptin, M., Grunewald, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+changes+during+gastrulation+in+Drosophila.">Cell shape changes during gastrulation in Drosophila.</a> Development. 110 (1), 73-84 (1990).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+movements:+the+logic+and+the+nuts+and+bolts.">Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Martin, A. C., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction:+themes+and+variations+on+a+cellular+mechanism+driving+morphogenesis.">Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis.</a> Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).</li><li>Dawes-Hoang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=folded+gastrulation,+cell+shape+change+and+the+control+of+myosin+localization.">folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization.</a> Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).</li><li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., H&#228;cker, U., Turck, C., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RhoGEF2+associates+with+microtubule+plus+ends+in+an+EB1-dependent+manner.">Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner.</a> Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).</li><li>Coravos, J. S., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+Sarcomere-like+Actomyosin+Contracts+Nonmuscle+Drosophila+Epithelial+Cells.">Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells.</a> Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).</li><li>Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+domain+polarization+localizes+actin-myosin+activity+to+drive+ratchet-like+apical+constriction.">Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).</li><li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abelson+kinase+(Abl)+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila.">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134 (3), 567-578 (2007).</li><li>Manning, A. J., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fog+signaling+pathway:+insights+into+signaling+in+morphogenesis.">The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis.</a> Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).</li><li>Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+G&#945;12/13+exacerbates+apical+area+dependence+of+actomyosin+contractility.">Loss of G&#945;12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).</li><li>Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+myosin+phosphorylation+regulates+contractile+pulses+and+tissue+integrity+during+epithelial+morphogenesis.">Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).</li><li>Parks, S., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gastrulation+gene+concertina+encodes+a+G+alpha-like+protein.">The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein.</a> Cell. 64 (2), 447-458 (1991).</li><li>Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GTPase+and+a+putative+RhoGEF+mediate+a+signaling+pathway+for+the+cell+shape+changes+in+Drosophila+gastrulation.">The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation.</a> Cell. 91 (7), 905-915 (1997).</li><li>Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+cell+signal+encoded+by+the+folded+gastrulation+gene+coordinates+cell+shape+changes+during+Drosophila+gastrulation.">A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation.</a> Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).</li><li>Peters, K. A., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ric-8+interacts+with+the+G&#945;12/13+subunit,+Concertina,+during+activation+of+the+Folded+gastrulation+pathway.">Drosophila Ric-8 interacts with the G&#945;12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).</li><li>Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Control+of+GPCR+Organization+and+Signaling+by+Endocytosis+in+Epithelial+Morphogenesis.">Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis.</a> Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).</li><li>Kerridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+activation+of+Rho1+by+GPCR+signalling+imparts+polarized+myosin+II+activation+during+morphogenesis.">Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).</li><li>Myat, M. M., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+shape+in+the+Drosophila+salivary+gland+is+controlled+by+regulated,+sequential+internalization+of+the+primordia.">Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia.</a> Development. 127 (4), 679-691 (2000).</li><li>Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+signaling+governs+the+cortical+stability+during+apical+constriction+in+Drosophila+gastrulation.">Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation.</a> Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).</li><li>Nikolaidou, K. K., Barrett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rho+GTPase+signaling+pathway+is+used+reiteratively+in+epithelial+folding+and+potentially+selects+the+outcome+of+Rho+activation.">A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation.</a> Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).</li><li>Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+line+of+Drosophila+Schneider+S2+cells+that+respond+to+wingless+signaling.">Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling.</a> Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).</li><li>Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+GTPase+inhibition+organizes+contraction+during+epithelial+morphogenesis.">RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

نقدم هنا، بروتوكول مفصل مقايسة contractility يستند إلى الخلية استخدام زراعة الأنسجة المورفولوجية خط خلية (S2R + الخلايا)، الذي يخضع انقباض الثاني الميوسين غير العضلات كاستجابة للضباب الإشارات. هذا التحليل مفيد للتحقيق في مسار الضباب، فضلا عن الآليات التي تنظم contractility الثاني غير العضلات الميوسين.
الاعتبارات استزراع الخلايا: الشروط التي S2R + الخلايا يتم في ظلها أمر حاسم لتحقيق بيانات موثوقة من هذا التحليل. عند التخطيط لإجراء الفحص contractility، هو أفضل وسيلة للحفاظ على S2R + الخلايا في متوسط حشرة درع وغنت M3. بينما S2R + الخلايا يمكن أن تزدهر في وسائل الإعلام ثقافة الخلية الحشرات الأخرى (مثلاً، متوسط حشرة SF900 أو شنايدر)، كثيرا ما تفقد قدرتها على الاستجابة للضباب. S2R + الخلايا التي تحتوي على رقم مرور عالية، الممرات عموما أكثر من 20-25، تبدأ بتفقد حساسية إلى [رني]. فمن الأفضل ﻻستخدام خلايا المرور المبكر لجميع التجارب. جانب مهم آخر للتجارب استنفاد [رني] هو اختيار عناصر التحكم المناسبة. تتضمن عناصر التحكم السلبية الشائعة دسرنا استهداف اجفب أو ببلويسكريبت، ولا من الذي يكون التماثل إلى جينوم ذبابة. استهداف البروتينات في مسار الضباب (رو، جمهورية كوريا، إلخ)، والتي، عندما تستنفد، منع تنشيط contractility الميوسين غير العضلات، وأيضا عناصر مفيدة. S2:Fog-يمكن الحفاظ على حركة الخلايا في وسيط ثقافة بديلة خلية مثل SF900 وتستكمل مع 100 وحدة/مل من البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، و 0.25 الامفوتريسين باء علما أن FBS مطلوب ليس عند استزراع الخلايا في SF900. كثافة الخلية أيضا عنصر حاسم في جميع جوانب المورفولوجية زراعة أنسجة الخلايا. خلافا لخلايا الثدييات زراعة الأنسجة، المورفولوجية-الخلايا المشتقة من زراعة الأنسجة تزدهر أفضل تحت أعلى الخلية الكثافة (الكثافة لا أقل من 5 × 105 خلايا/مل). ومع ذلك، عند إجراء هذا الفحص، المهم أن الخلايا هي مطلي لا يخدع A-المغلفة بالاطباق زجاجية أعلاه التقاء 80%، التحديد الكمي للمتعاقد معها مقابل عدم التعاقد مع الخلايا سوف تصبح مملة جداً.
الجوانب الحرجة والنهج البديلة للفحص الخلوي كونتراكتيليتي: إنتاج الضباب، يجند أن يطلق الميوسين غير العضلات كونتراكتيليتي الثاني، عنصر أساسي في هذا التحليل. بترميز الجينات الضباب وتين أحماض الأمينية 730 مع وزن الجزيئي توقع ~ 78 كاتشين26. وكشف تحليل هيدروباثي تمتد من بقايا مسعور 12 في الأمينية-المحطة النهائية في الضباب التي يمكن أن تعمل كتسلسل إشارة إفراز. وبالإضافة إلى ذلك، يحتوي أيضا على مواقع متعددة لاحتمال glycosylation N و O مرتبطة، كذلك اقتراح الضباب هو بروتين يفرز26تسلسل الترميز. ودعما لذلك، كان المترجمة الضباب إلى الحويصلات الافرازية في خلايا البشرة الظني تمر انقباض قمي16. حملت حركة الضباب التعبير عند إضافة كبريتات النحاس إلى المتوسط، والأجسام المضادة ضد الضباب أو حركة المعترف بها بروتين 150 ديناراً من الثقافة المتوسطة تحصد من الثقافات المستحث ولكن ليس من فعل وسائط الإعلام من الخلايا S2 تفتقر إلى بناء حركة الضباب. هذا الوزن الجزيئي أعلى من الوزن الجزيئي 80 ديناراً المتوقعة من الضباب ويوحي بأن الآلية الافرازية للخلايا S2 قد جليكوسيلاتي البروتين قبل الرقابة. بسبب التقلبات المحتملة في تنقية الضباب، فمن المستحسن استخدام نفس الدفعة وسائط الضباب مكيفة لجميع التجارب. يشكلون مجموعات كبيرة من مركزة الضباب-حركة وسائط سيساعد في الحفاظ على الاتساق في جميع جولات التجارب.
أن نجاح هذا الفحص يعتمد أيضا على ثقة تحديد الخلايا التي مرت بانقباض. في حين يمكن ملاحظة الخلايا مقيدة بالفحص المجهري الأسفار، تلطيخ أكتين أو غير العضلات الميوسين الثاني، الطريقة الأكثر موثوقية لتحديد وتقدير حجم الخلايا مقيدة من خلال مرحلة التباين أو مجهرية DIC. التهم دقيقة يمكن تحقيقه باستخدام 20 X-40 X التكبير على مجاهر الخفيفة القياسية. على الرغم من أن يستخدم البروتوكول مكتوب هنا أطباق زجاجية، المقايسة يمكن أيضا إجراء باستخدام معيار الزجاج 1.5 كوفيرسليبس مغلفة بألف يخدع يمكن أن يتم إضافة الضباب في 35 مم لزراعة الأنسجة في ساترة وضعها في بارافيلم، بغية الحد من الضباب المستخدمة لفحص كل. نوعية التثبيت عنصر حاسم للمقايسة، الخلايا الثابتة سيئة يمكن أن يؤدي إلى إيجابيات كاذبة. استخدام الحل تثبيت الطازجة، والتأكد من أن الخلايا الجافة ابدأ مرة واحدة ثابتة سيؤدي إلى نتائج أكثر موثوقية. وأخيراً، من المهم لعد عدد كبير من الخلايا. عادة، فقط 30%-50% من دون علاج أو انقباض الخلايا المعالجة [رني] التحكم بعد نضح الضباب. ومع ذلك، هناك مستوى القاعدية لانقباض التي تحدث في S2R + الخلايا، حيث هناك حاجة إلى عدد كبير من الخلايا للتأكد من أي تغيير في جزء صغير خلايا مقيدة بسبب العلاجات. وعلاوة على ذلك، نضوب بعض البروتينات المشاركة في تنظيم كونتراكتيليتي الثاني الميوسين غير العضلات قد يؤدي إلى فرط contractility، حتى في حالة عدم وجود الضباب. البيانات المعروضة هنا من أكثر من 3,600 الخلايا التي تم حسابها في ثلاثة علاجات [رني] متعاقبة باستخدام نفس الدفعة من الضباب مكيفة وسائل الإعلام.
تطبيقات للفحص الخلوي كونتراكتيليتي: ويوفر هذا الإنزيم contractility، عندما يقترن مع [رني] فحص أساليب، نظاما قويا لدراسة الخلية إشارات و morphogenesis و contractility الخلوية. سابقا، قد استخدمت للتعرف على واحد من اثنين من مستقبلات المشارك الضباب21. شاشة مستهدفة من 138 إلى جانب البروتين ز مستقبلات (جبكرس) يتم استنفادها في [رني] في S2R + الخلايا، وقدرته على الاستجابة للضباب كان جزيئي كما هو موضح في البروتوكول المعروضة هنا. جبكرس 138، واحد، جين أونتشاراكتيريزيد سابقا، المعروفة الآن بالضباب، وكان كشفت. أظهر التحقيق في الدالة من الضباب أن يتطلبها contractility الخلوية المستحثة بالضباب في S2R + الخلايا، بل من الضروري أيضا جاستروليشن في تطوير المورفولوجية21. وعلاوة على ذلك، استخدمت هذا الفحص لإثبات أن ريك-8، مرفق البيئة العالمية غير متعارف عليه، أيضا عنصر في الضباب مما يشير إلى المسار27. أظهرت سلسلة من التجارب [رني] epistasis مقترنة بمقايسة contractility أن ريك-8 يتفاعل مع Gα12/13 وحدة فرعية كبار المستشارين التقنيين ومهامها إلى ترجمة ذلك داخل الخلية، هو أمر حيوي ل contractility الخلوية المستحثة بالضباب31 .
زراعة الأنسجة المورفولوجية مناسبة تماما للمبتدئين، الخلايا تمسك بسهولة في درجة حرارة الغرفة، ولا تتطلب CO2 أو مخزنة خلية الثقافة المتوسطة، وقوية ما دامت تتم المحافظة على كثافة ثقافة الخلية الصحيحة. الفحص الخلوي contractility أنجز بنجاح قسم المختبر دورة بيولوجيا الخلية قبل التخرج، حيث كان الطلاب القليل إلى أي خبرة في تثقيف الخلايا أو الفحص المجهري. والرزن contractility الخلوية المقدمة هنا يمثل أداة قوية، ويستند إلى الخلية التي يمكن أن تستخدم في اكتشاف الجينات، أو استجواب الضباب مما يشير إلى المسار، تساعدنا على تحسين فهم العمليات الإنمائية، من قبيل انقباض قمي و الميوسين غير العضلات كونتراكتيليتي الثاني، بصورة عامة.

وأثبتت الدراسات embryogenesis أجريت مع الكائنات نموذج الجينية لا تقدر بثمن لفهمنا لكيفية تجميع الخلايا في الأنسجة. الدراسات المورفولوجية ميلانوجاستير، على وجه الخصوص، أدت إلى تحديد الجينات الرئيسية والمبادئ البيولوجية أن المباشرة في morphogenesis والتنمية من الكائنات الحية من الإخصاب إلى مرحلة البلوغ1،2 , 3-بالتوازي مع البحث الجيني الذي أجرى مع المورفولوجية، خطوط الخلايا المستزرعة المستمدة من الأنسجة ذبابة الفاكهة وظهرت أيضا كنظام قوي لمعالجة مجموعة واسعة من الجزيئات والخلايا البيولوجية الأسئلة4، 5 , 6- المورفولوجية زراعة أنسجة خلايا لها متطلبات الحد الأدنى للصيانة، كما أنها تربى في درجة حرارة الغرفة ودون CO2. على هذا النحو، فقابله للتصوير عالي الدقة، ولديهم درجة عالية من القابلية لتثبيط الجينات [رني]6،7. العديد من المجموعات قد استخدمت خلايا الأنسجة ثقافة المورفولوجية كأداة لاكتشاف الجينات المعنية في تحديد شكل الخلية وديناميكية cytoskeletal والجدوى، البلعمه والإشارات تنبيغ مسارات4،8، 9،،من1011. عندما تستخدم كنموذج جنبا إلى جنب مع الحيوان كله، خطوط الخلايا المورفولوجية المستزرعة توفر مجموعة من نهج تكميلية جداً أن التعجيل بتحديد الجزيئات الهامة لتطوير وتوفير إطار تحديد هذه الأدوار آليا إلى12. هنا، نحن تصف تحليل يستند إلى الخلية لدراسة مسارات الإشارات التي تؤدي إلى انقباض قمي عبر gastrulation مطوية (الضباب) مسار13،14. يسمح هذا التحليل يستند إلى الخلية contractility الباحثين للتحقيق على حد سواء الضباب مما يشير إلى المسار والآليات الجزيئية التي تنظم contractility الثاني غير العضلات الميوسين.
ودرست gastrulation الجنين المبكر المورفولوجية لسنوات عديدة كنموذج الجيني morphogenesis الظهارية والانتقال الخلوية من الظهارية إلى هوية الخلايا الوسيطة. واحدة من الأحداث الرئيسية التي وقعت في جاستروليشن هو morphogenesis لمجموعة فرعية خلايا الظهارية على طول خط الوسط البطني الجنينية من عمودي إلى الهرمية في الشكل15،16،،من1718. تغيير النتائج في استيعاب الخلايا ميسوديرمال الظني هذا الشكل خلية بسيطة وتحركها النشاط الحركي من الميوسين غير العضلات ثانيا تقيد أكتين الشبكة16،،من1920. عقود أبحاث الجينية وحددت المكونات الجزيئية لهذا المسار ووضعت لهم التسلسل بالترتيب التالي: 1) ويفرز الضباب من المجال قمي من الخلايا الظهارية في خط الوسط البطني؛ 2) الضباب بربط إلى جانب البروتين ز المشارك المستقبلات، الضباب والضباب الدخاني، وإشارات عن طريق هيتيروتريميريك ز-البروتين المعقدة التي تحتوي على وحدة فرعية12/13 Gα سلك شائك (Cta)، الذي هو تشابيرونيد ريك "مرفق البيئة العالمية" غير المقبول-8؛ 3) تنشيط كبار المستشارين التقنيين جوانين النوكليوتيدات صرف عاملاً، RhoGEF2، الذي بدوره يقوم بتنشيط Rho1 ز-البروتين الصغيرة؛ 4) Rho1 ينشط رو كيناز (جمهورية كوريا)؛ 5) كوريا الجنوبية ينشط الميوسين غير العضلات كونتراكتيليتي الثاني في المجال قمي من خلال الفسفرة السلسلة الخفيفة التنظيمية (RLC)، وبالتالي إنتاج انقباض قمي (الشكل 1)15،21،22 23، ،،من2426،25،27،،من2829. الطفرات في العديد من هذه العناصر تتداخل مع جاسترولاتيون العادية وغيرها من الحركات مورفوجينيتيك، بما في ذلك تكوين القرص الجناح والغدد اللعابية، مما يشير إلى أن يتم استخدام هذا المسار في عدة مراحل من المورفولوجية امبريوجينيسيس30،،من3132. مسار الضباب هو واحد من النماذج أفضل درس لتشكيل الظهارية، وقدمت أفكاراً هامة في morphogenesis كيف مستوى الأنسجة وينظم من النسخ الجيني للخلية cytoskeleton يحركها حركات14،15 ،21.
لقد طورنا مقايسة contractility يستند إلى الخلية التي يلخص الردود كثيرة على الهاتف الخلوي المصب من الضباب التي لوحظت في تطوير الأجنة يطير17. نحن إجراء هندسة عكسية S2 مستقرة معلم خط الخلية التي تعرب عن الضباب في نهايته ج مع حركة تحت سيطرة مروج ميتالوثيونيني إيندوسيبلي التي يمكن أن تحصد عند إضافة كبريتات النحاس (CuSO4) إلى المتوسط. عندما يتم تطبيق وسائل الإعلام مكيفة الضباب اكتوبيكالي على مستقبلات S2 + (S2R +) الخلايا، وسبليني الخلايا S2 يتميز بهم التعبير التفاضلية من مستقبلات مثل مفارز فريزليد وانتغرين، الخلايا الخضوع لإعادة تنظيم سيتوسكيليتون تذكرنا بدرجة عالية من انقباض قمي12،17،،من2733. ويمكن ملاحظة هذه التغييرات بالتباين مرحلة الفحص المجهري في الضباب الذي العلاج يؤدي إلى ظهور الكشكشة الظلام-المرحلة الإرشادية زيادة شعاعي في contractility الثاني الميوسين غير العضلات، أو بالأسفار الفحص المجهري حيث يؤدي العلاج الضباب إلى تشكيل عصابات الثاني الميوسين غير العضلات في الخلايا معربا عن معلم اجفب RLC34. وتتضمن هذه الحلقات سلسلة خفيفة تنظيمية فوسفوريلاتيد الميوسين (برلك) مرئية عبر إيمونوستينينج23،34،35. تتطلب هذه الاستجابة التي يسببها الضباب كبار المستشارين التقنيين، RhoGEF2، رو، وجمهورية كوريا؛ وهكذا، باستخدام S2R + خلايا والمؤتلف حركة الضباب، أنشأنا وسيلة للتحقيق انقباض المستحثة بالضباب في نظام يقوم على ثقافة الأنسجة24،25،34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1157">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td style="width:123px;">150</td>
			<td style="width:496px;">cell culture line, undergoes apical constriciton</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2:Fog-myc cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>218</td>
			<td>cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ :Sqh-EGFP cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>196</td>
			<td>cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Shield and Sang M3</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3652</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">SF900 insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>12658019</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Schneider&#8217;s insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
			<td>antimicrobial/antifugal media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:223px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">150710</td>
			<td>used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass bottom plates</td>
			<td style="width:223px;">Maktek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-10</td>
			<td>used for assay and for fixing and staining cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">2940-225</td>
			<td>alternative to glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Protein concentrators</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC903008</td>
			<td>30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:317px;">25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-204,25-206,25-208,25-210</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6-well and 12-well tissue culture dishes</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-105, 25-106</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Flourescent mounting medium</td>
			<td style="width:223px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S3023</td>
			<td>to preserve fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">32% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">15714-S</td>
			<td>used to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pipes</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19240</td>
			<td>used in PEM buffer for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Anti-Myc Antibody</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Hybirdoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">cat# 9E10</td>
			<td>used to dectect Fog-Myc&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">PhosphoSerine-19 antibody</td>
			<td style="width:223px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:123px;">3671</td>
			<td>antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">488-Phalloidin, 568-Phalloidin</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A12379, A12380</td>
			<td>to stain for f-actin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hawk-VT multi-point array scanning confocal system&#160;</td>
			<td style="width:223px;">VisiTech International</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Eclipse TE300 Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells

وقد وضعنا يستند إلى الخلية مقايسة استخدام الخلايا المورفولوجية التي يجمل انقباض قمي بدأها gastrulation مطوية (الضباب)، مورفوجين طلائي يفرز. في هذا التحليل، كالضباب مؤثر لتنشيط رو من خلال سلسلة إشارات تتضمن مستقبلات (ميست) إلى جانب البروتين ز وبروتين Gα12/13 (سلك شائك/Cta)، والتي تحتوي على مجال بدز جوانين النوكليوتيدات تبادل عامل (RhoGEF2). الضباب مما يشير إلى النتائج في إعادة تنظيم cytoskeleton أكتين لتشكيل سلسلة مال الهوس سريعة ودراماتيكية. الضباب للذوبان يتم جمعها من خط خلية مستقرة وتطبيق اكتوبيكالي S2R + الخلايا، مما يؤدي إلى التغييرات الشكلية مثل انقباض قمي، لوحظت عملية خلال العمليات الإنمائية مثل جاسترولاتيون. هذا التحليل هو قابلة للفرز الفائق، واستخدام [رني]، يمكن أن تسهل تحديد جينات إضافية تشارك في هذا المسار.

S2 و S2:Fog-حركة الخلايا كانت تزرع لظروف المتلاقية في قارورة زراعة الأنسجة 150 سم2 بالقرب وتعامل مع 25-75 ميكرون CuSO4 على مدى فترة من 24-48 ساعة للحث على التعبير عن الضباب-حركة (الشكل 2). عينات من خلايا S2 (الشكل 2ألف) و S2:Fog--أزيلت حركة الخلايا (الشكل 2ب) وإنتاج حركة الضباب كان يرصدها لطخة غربية. كما هو متوقع، فشلنا في الكشف عن حركة الضباب في وسائل الإعلام التي تحصد من الخلايا S2 تحت أي ظروف. بيد أننا كشف الضباب في وسائل الإعلام التي تحصد من S2:Fog-حركة خط الخلية مستقرة لها في أقرب وقت بعد التعريفي مع 75 ميكرون CuSO424 ساعة. S2R + الخلايا المرفقة يخدع A-المغلفة بأطباق زجاجية معربا عن معلم اجفب تنظيمية خفيفة سلسلة (بروتينات فلورية خضراء-RLC) غير العضلات الميوسين الثاني (الأرقام 3A و 3 باء). أجرى تصوير خلية يعيش على مجهر مقلوب مجهزة 100 X/1.4 عدسة الهدف نا خلال نضح مكيفة الضباب وسائط الإعلام. حوالي 5 دقائق بعد العلاج مع حركة الضباب، شكلت RLC الخواتم يدل على انقباض العضلات غير الميوسين الثاني. يمكن ملاحظة هذه الحلقات عن طريق immunostaining S2R + الخلايا بجسم المثارة ضد فوسفوبيبتيدي اصطناعية المقابل لبقايا المحيطة Ser19 الميوسين البشرية RLC (الأرقام 4A و 4B). هذه الأجسام المضادة كروسريكتس مع المورفولوجية RLC.
ولدينا هنا مثال ممثل للانزيم كونتراكتيليتي الخلوية بعد علاج 7 أيام من الخلايا التي تحتوي على عنصر تحكم [رني] ودسرنا ضد Rho1 (5A الأرقام - 5E). S2R + الخلايا كانت مطلية على الاشتراكات A-المغلفة بأطباق زجاجية وتعامل مع الضباب مكيفة (+ الضباب) وسائط الإعلام أو مراقبة وسائط الإعلام (-الضباب). ثم تم قياس كمية عدد الخلايا المتعاقد عليها بعد التثبيت. الإرشادي الكشكشة المرحلة كثيفة من انقباض كان بارزا في التحكم استنفاد الخلايا تعامل مع وسائل الإعلام مكيفة الضباب (الشكل 5ب). في الشكل 5ج، خلايا المنضب رو تعامل مع مكيفة S2 المتوسطة مثال نموذجي مورفولوجية ذات حواف ناعمة، مثل البيض المقلي. ملاحظة أن رو يلعب دوراً في مسار الإشارات الضباب، وكذلك في cytokinesis؛ وبالتالي، تفشل الخلايا المنضب رو غالباً ما لتقسيم بشكل صحيح، مما يؤدي إلى زيادة في حجم الخلايا وبلويدي. العلاج لمراقبة الخلايا المنضب مع وسائل الإعلام مكيفة الضباب نموذجي يؤدي إلى 30-50% خلايا تمر بانقباض، بينما نحن فشلت في مراعاة انقباض كبيرة في الخلايا المنضب رو.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig1.jpg"> الشكل 1:الضباب المفترضة إشارات الطريق. نظراً لغياب الضباب، Gα12/13 وحدة فرعية، سلك شائك (Cta)، جنبا إلى جنب مع شركائها ملزمة Gϒ و Gβ، غير نشطة والمرتبطة بمستقبلات المشارك الضباب والضباب الدخاني. ريك-8 مشرفات كبار المستشارين التقنيين، وينظم به التعريب سوبسيلولار. عند الضباب ملزمة، ينأى كبار المستشارين التقنيين من Gϒ، و Gβ المجندين RhoGEF2 لغشاء الخلية حيث أنه يحفز التبادل للناتج المحلي الإجمالي لأنشئ في Rho1 جتباسي الصغيرة. Rho1 أنشئ زمنياً، نشط الآن، ينشط "كيناز رو" (جمهورية كوريا)، الذي فوسفوريلاتيس RLC الميوسين غير العضلات، مما يؤدي إلى التنشيط و contractility الخلوية اللاحقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig2.jpg"> الشكل 2 : الوقت-بالطبع إنتاج حركة الضباب. هذه اللوحات تظهر الخلية الثقافة المتوسطة حصادها من قرب قارورة المتلاقية 100 ٪ من الخلايا التحكم S2 (أ) أو (ب) S2:Fog-حركة خلايا مستقرة. الخلايا تعامل مع 25-75 ميكرون CuSO4 على مدى فترة من 24-48 ساعة. مستنبت الخلية كان جمعها وإعدادها للحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاف الغربية. تم الكشف عن حركة الضباب بجسم حركة مناهضة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig3.jpg"> الشكل 3 : خلية يعيش التصوير من انقباض الناجمة عن الضباب. مستقرة S2R + خطوط الخلايا معربا عن معلم اجفب RLC لغير العضلات الميوسين الثاني تم تصويرها التي اجتاحت حقل [كنفوكل] مجهرية أثناء التروية مكيفة الضباب وسائط الإعلام. يتم عرض الوقت بالدقائق والثواني. (A) هذا الفريق يظهر صورة تنسيق الطائرة قريبة من واجهة ساترة خلية الوقت 0:00 قبل التروية من الضباب--Myc. (ب) هذا الفريق ويبين سلسلة زمنية (0:30-10:00) من الصور التي التقطت في المستوى البؤري القرب من الجزء العلوي من الخلية. الأسهم البيضاء تشير إلى إعادة تنظيم غير العضلات الميوسين الثاني حسبما أوضحه RLC اجفب إلى عصابات الهوس أثناء انقباض. هو شريط مقياس 10 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig4.jpg"> الشكل 4 : فوسفوريلاتيد RLC يموضع لعصابات الهوس بعد الاستقراء انقباض بالضباب--Myc. S2R + الخلايا الثابتة والملون أكتين باستخدام فالويدين (أحمر)، فوسفوريلاتيد RLC استخدام جسم فوسفوسيريني-19 (أخضر) و DAPI (DNA، الأزرق)، وبعد العلاج مع مراقبة () أو (ب) وسائل الإعلام الضباب-حركة-مكيفة. ملاحظة إعادة تنظيم RLC فوسفوريلاتيد في الحلقات عند إضافة الضباب--Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig5.jpg"> الشكل 5 : الممثل الكمي للانزيم كونتراكتيليتي الخلوية المستحثة بالضباب. S2R + الخلايا تعامل مع عنصر التحكم (A و B) [رني] أو دسرنا (C و D) ضد Rho1 جتباسي الصغيرة لمدة 7 أيام. بعد هذا الوقت، كانت مطلية على أطباق زجاجية المغلفة من A يخدع الخلايا وتعامل مع الوسائط التحكم (A و C) أو الوسائط (ب ود) الضباب-حركة-مكيفة. يشير الحجم شريط يمثل 10 ميكرون. (ﻫ) مؤامرة مبعثر بفواصل الثقة 95% ويعني لجزء صغير خلايا التعاقد مع كل حالة. تمثل النقاط الفردية جزء صغير خلايا التعاقد مع كل حقل من عرض في 40 X التكبير (10-120 الخلايا كل حقل) والأرقام بين قوسين تشير إلى العدد الإجمالي للخلايا تحسب للتعاقد وعدم التعاقد مع خلايا منفصلة على مدى ثلاث [رني] تجارب. تدل العلامات النجمية فرقا يعتد به إحصائيا بين شروط معاملة [رني] والضباب كما يحددها أحادي الاتجاه ANOVA (ف < 0.0001) مع المقارنة متعددة الوظائف المخصصة التحليل في توكي. لاحظ أنه لا يوجد أي فرق معتد به إحصائيا (نوفاسكوتيا) بين العينات المعالجة Rho1 [رني] تعامل مع عنصر تحكم أو الضباب-حركة-تكييف وسائل الإعلام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

هنا يصف لنا مقايسة contractility المورفولوجية S2R + الخلايا باستخدام. ويؤدي التطبيق [ليغند] خارجية، مطوية جاستروليشن (الضباب)، إلى تفعيل الضباب مما يشير إلى كونتراكتيليتي المسار والخلوية. يمكن استخدام هذا الفحص للتحقيق في تنظيم البروتينات الخلوية كونتراكتيليتي في الضباب مما يشير إلى المسار.

تحليل يستند إلى الخلية للتحقيق غير العضلات الميوسين الثاني Contractility عبر gastrulation مطوية إشارات الطريق في المورفولوجية S2R + الخلايا

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

This method can help answer key questions in the fields of cell and developmental biology, such as which proteins are involved in the regulation of non-muscle myosin-II contractility and which proteins are key in the folded gastrulation or fog-signaling pathway. The main advantage of this technique is that, coupled with RNEI depletion, the cellular-contractility assay can be used as a tool for gene discovery for proteins involved in fog signaling and non-muscle myosin-II contractility. The implications of this technique extend toward our basic understanding of development.Non-muscle myosin-II contractility is universally critical to cell-shape change, or morphogenesis, that occurs during development. Though this method can provide insight into the development of drosophila, it can also be applied to other systems, because it is critical to a whole host of other cellular functions. Generally, individuals new to this method will struggle because getting correct cell density and recognizing the difference between contracted and non-contracted cells can be difficult.To begin, coat the glass portion of 35-millimeter glass-bottomed dishes with 200 microliters of con-A solution. Incubate the dishes for approximately two minutes at room temperature in a tissue-culture hood. After this, remove the con-A solution, and allow the dishes to air-dry completely.Add approximately two milliliters of fresh cell-culture media to each of the glass-bottomed dishes. Then, resuspend the S2R+cells by pipetting the cell-culture medium up and down. Transfer the resuspended S2R+cells to the prepared glass-bottomed dishes.Then, check the cell density under a tissue-culture microscope by focusing up and down through multiple planes of cells. Establishing the initial cell density is critical. Too few cells will make it difficult to quantify, and too many cells will make quantification tedious.Use the microscope to focus up and down the dish to estimate the number of cells. Next, allow the cells to attach to the con-A-coated glass-bottomed dishes for 45 to 60 minutes. First, gently pipette to remove all of the cell-culture medium from the attached S2R+cells.Then, carefully add back 75 microliters of fresh medium. Next, add 75 microliters of fog-conditioned media to the glass portion of the dish. Using phase-contrast microscopy at 20 times or 40 times magnification, monitor the contractility of an entire field of cells.Track the morphology of the cells for the alternating pattern of phase dark-and-light ruffling, characteristic of shape change. Correctly identifying cells undergoing contraction can be hard the first time. As the cells contract, phase dark and light ruffles will form, making the cell appear like a starburst.Fix the S2R+cells with a 10%paraformaldehyde solution. Then, pipette to remove the cell-culture medium from the fog-treated S2R+cells, and replace it with 1.5 to two milliliters of the paraformaldehyde solution. Incubate both the S2R+cells and the fog-treated S2R+cells for 15 minutes at room temperature.Next, use a pipette to remove the paraformaldehyde solution, and dispose of the waste properly. Then, rinse the cells with PBS three times to remove any residual fixation solution. Block the cells with 200 microliters of 5%normal goat serum in PBS supplemented with 0.1%PBST for 20 minutes at room temperature.Next, dilute the primary antibody in PBST, using a volume of approximately 200 microliters to completely cover the glass portion of the dish. Use a pipette to remove the blocking solution, and add the primary antibody solution directly to the glass portion of the dish. Then, incubate for one hour at room temperature.After this, use a pipette to remove the primary antibody solution, and rinse the cells with fresh PBS three times. To prepare the secondary antibody solution, dilute the secondary antibody in PBST. Then, add the secondary antibody solution directly to the glass portion of the dish.Incubate the dish for one hour at room temperature. After this, use a pipette to remove the secondary antibody solution, and rinse the cells with fresh PBS three times. Then, add sufficient anti-fade fluorescent mounting medium to cover the glass portion of the dish.Store the samples at four degrees Celsius away from any light. First, use 20 times or 40 times magnification to capture 10 to 30 non-overlapping image fields of the fixed cells. Finally, use a standard cell counter to count and record the number of contracted and non-contracted cells in each of the captured fields.Using this protocol, S2 and S2 fog-myc cells were grown and treated with copper sulfate to induce the expression of fog-myc. Unsurprisingly, fog-myc was not detected in the S2 cells under any conditions. However, fog was detected in media harvested from the S2 fog-myc-stable cell line as early as 24 hours after induction with copper sulfate.Approximately five minutes after treatment with fog-myc, the RLC formed rings indicative of non-muscle myosin-II constriction. In a representative cellular-contractility assay, the phase-dense ruffles indicative of constriction were prominent in control-depleted cells treated with fog-conditioned media. Rho-depleted cells treated with S2-conditioned medium demonstrated typical smooth-edged fried-egg-like morphology.While attempting this procedure, it's important to remember time and the quality fixation is important. After 10 minutes, cells begin to relax, so the cells should be fixed before this time. Poor fixation conditions can lead to the false positives.Using this assay, researchers identified mist, one of the two fog coreceptors. This assay was also used to get a better understanding of the role of rigate during fog signaling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

تحليل يستند إلى الخلية للتحقيق غير العضلات الميوسين الثاني Contractility عبر gastrulation مطوية إشارات الطريق في المورفولوجية S2R + الخلايا

Abstract