Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Rogers Lab og Applewhite lab, Greta Glover, og de studerende i Reed colleges foråret 2018 cellebiologi kursus, der har bidraget til udviklingen af denne protokol. Desuden vil forfatterne gerne takke medlemmerne af Ritz lab for omhyggeligt læse og redigere dette håndskrift. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Science Foundation award nummer 716964 D.A.A. og A.R. og Reed College biologi afdeling.

1. vedligeholdelse af Drosophila vævskultur celler
<ol><li>Vedligeholde S2R +, S2R +: RLC-EGFP og S2:Fog-Myc cellerne ved stuetemperatur, helst mellem 20 ° C og 25 ° C, i skjold og Sang M3 insektvoks mellemstore suppleret med 10% føtal bovint serum, 100 enheder/mL af penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 0,25 amphotericin B på en tæthed ikke er lavere end 5 x 105 celler/mL. Bemærk: Lavere celle tætheder føre til døden.</li>
	<li>Hurtigt optø cryo-konserveret hætteglas af celler og overføre dem til en vævskultur kolbe. Starte med en lille vævskultur kolbe (12,5 cm2 eller 25 cm2) i et volumen på 4-5 mL i cellekulturmedium indtil kulturen er etableret og tegn på celledød skyldes optøning har aftaget. Bemærk: Tegn på celledød skyldes optøning omfatter ikke-tilhænger celler, der mangler et glat, afrundet form og små mørke bits af celleaffald i vævskultur medium vejledende af nekrotiske celler.</li>
	<li>Langsomt skala op størrelsen af væv kultur ved at tillade celler til at vokse uforstyrret i flere dage (4-8 d) til 100% confluency, hvor der er lidt at ingen mellemrum mellem celler, og de begynder at hobe sig op på hinanden. Overføre alle celler fra denne 100% sammenflydende mindre 12,5 cm2 eller 25-cm2 kolben til en større vævskultur kolbe (af 75 cm2) suppleret med 10 mL i cellekulturmedium. Bemærk: Fastholde celler i en kolbe på 75 cm2 vil give nok celler for de fleste eksperimenter.</li>
	<li>Passage cellerne hver 3-4 d af pipettering cellekulturmedium op og ned, bruge det til at løsne nogen løst overholdt celler i vævskultur plastic. Overføre dette medium, der nu indeholder de resuspenderede celler, i en frisk kolbe. Fortynd celler 1:4 med friske cellekulturmedium med hver passage og Gentag efter behov.</li>
</ol>2. RNAi behandling af Drosophila S2R + celler
Bemærk: Henvise til Rogers og Rogers6 for detaljerede instruktioner om, hvordan man producerer dsRNA egnet til insekt kultur.
<ol><li>Overføre S2R + celler til en 6-godt eller 12-godt vævskultur plade med en tæthed, der er befordrende for levedygtighed, ikke er lavere end 5 x 105 celler/mL, med komplet skjold og Sang M3 celle kultur medier for RNAi behandlinger.</li>
	<li>Arbejder i en vævskultur hætte, fjerne den gamle cellekulturmedium ved forsigtigt vippe 6-godt eller 12-godt vævskultur plade og sugning cellekulturmedium med en pipette. Hurtigt erstatte denne gamle cellekulturmedium med friske cellekulturmedium 1 mL af pipettering det i hver brønd. Bemærk: Dette kan gøres uden væsentlige tab, når cellerne har fået lov at løst overholde for 30-45 min før udveksling i cellekulturmedium.</li>
	<li>Tilføje 10 µg/mL af dsRNA, der er oprettet efter detaljerede protokollen i Rogers og Rogers6 af pipettering det direkte ind i vævskultur medium af hver brønd af celler pr. RNAi tilstand.</li>
	<li>Gentag denne procedure dagligt, erstatter cellekulturmedium med 1 mL frisk medium og 10 µg/mL af dsRNA pr. RNAi tilstand. Bemærk: RNAi eksperimenter er typisk udført for 7 d; den præcise timing er dog afhængig af protein omsætning og virkning af dsRNA. RNAi behandlinger så kort som 3 d nedbryder effektivt cellerne i visse proteiner, mens andre mål kræver længere behandlinger6.</li>
</ol>3. tåge produktion og høst
<ol><li>Skalere op vækst af S2:Fog-Myc celler ved at tillade dem at vokse uforstyrret for 4-8 d til at opnå en næsten 100% sammenflydende 75 cm2 kolbe af celler i 10 mL af celle næringssubstratet (eller alternativt en 150-cm2 kolben i 20 mL i cellekulturmedium) til maxi batterikapacitet tåge produktion.</li>
	<li>Tilsæt 50 µL af 100 mM CuSO4 (eller 100 µL af 100 mM CuSO4 for en 150-cm2 kolbe) til næsten 100% sammenflydende 75 cm2 kolben til induktion af metallothionine promotor. Der inkuberes i 48 timer ved stuetemperatur.</li>
	<li>Fjerne den tåge-Myc-holdige medium fra vævskultur kolbe af pipettering og overføre det til en 15 mL eller 50 mL konisk slange. Der centrifugeres ved 2.500 x g ved 4 ° C i 10-15 min at rydde celler og celleaffald.</li>
	<li>Overføre ryddet celle medium til et nyt koniske rør og vedligeholde det på is. Arbejde i partier, overføres 5 mL ryddet medium til 15 mL af 3.000 MW koncentratorer med celluloseregenerater membraner og centrifugeres det på 2.500 x g ved 4 ° C i 30 min ad gangen, til at koncentrere mediet. Bemærk: Alternativt en koncentrator med en større volumen kapacitet kunne være brugt (50 mL). Under koncentration, vil en mørkere farvet medium, som er beriget med tåge, begynde at bygge i bunden af filteret V-formet.</li>
	<li>Indsæt pipette tip til bunden af "V" i koncentratoren og fjerne de mørkere farvede medier mellem hver runde af centrifugering og overføre det til en frisk 1,7-mL mikrofuge tube. Fastholde medie på is.</li>
	<li>Ved hjælp af den samme koncentrator, Gentag trin 3.4 og 3.5 ved at fjerne den mørkere farvede koncentreret tåge-Myc medier og erstatte den med mere precleared medium, indtil mediet har været koncentreret til 1/10th af den originale lydstyrke (dvs., 1 mL 10 ml af udgangsmaterialet).</li>
	<li>Gemme den koncentrerede tåge-Myc ved 4 ° C. Bemærk: Efter opbevaring, skal du sørge for at overvåge for bakteriel forurening, som kan forekomme efter længere perioder af opbevaring.</li>
	<li>Udføre SDS-PAGE ved at blande 10 µL af koncentreret tåge-Myc medium med 10 µL af en denaturering SDS-holdige buffer til at danne en lysate. Køre SDS-PAGE gel på 35 mA for ca 1 h. overføre gel til en nitrocellulose membran (eller alternativt en PVDF membranen) i 1 time på 120 mA. Udføre en vestlige skamplet af enhver kommercielt tilgængelige Myc antistof til påvisning af en 150-kDa band. Bemærk: Koncentrationen af tåge-Myc i konditioneret mediet kan variere pr. parti. Det er ikke nødvendigt at bestemme den nøjagtige koncentration af tåge-Myc for at udføre analysen, men effekten af hver batch bør testes, før du udfører et eksperiment.</li>
	<li>Følgende trin 3.1-3.2, forberede kontrol S2-aircondition medier ved at indsamle 10 mL i cellekulturmedium fra en næsten 100% sammenflydende 75 cm2 kolbe af S2 celler (eller, alternativt, 20 mL fra en 150-cm2 kolbe) af pipettering. Overførsel kontrol S2 cellekulturmedium til en frisk 15 mL eller 50 mL konisk slange.</li>
	<li>Følgende trin 3.4-3.7, klare lysate af celler og celleaffald ved centrifugering (på 2.500 x g ved 4 ° C i 30 min ad gangen) og derefter overføre cellen ryddet lysate til koncentratorer og centrifugeres dem at koncentrere kontrol medium i partier til 1/10th den originale lydstyrke. Bemærk: Anvendelse af S2-aircondition medier fører ikke til væsentlig celle kontraktilitet i analysen.</li>
	<li>Gemme den koncentrerede S2 kontrol medier ved 4 ° C i flere måneder. Bemærk: Efter opbevaring, skal du sørge for at overvåge for forureningen.</li>
</ol>4. forberedelse af Concanavalin-A-belagt glas-bund retter og klædningen af S2R + celler
<ol><li>Gøre 10 mL af concanavalin et (con A) løsning ved at opløse 5 mg af con A i 10 mL vand til en endelig koncentration på 0,5 mg/mL. Alikvot denne løsning i mere bekvem diskenheder (500 µL til 1 mL), og opbevar den ved-20 ° C.</li>
	<li>Forbered 35-mm glas-bund retter ved belægning glas del af hver tallerken med 200 µL af opløsningen con A og inkuberes retter for ca. 2 min. ved stuetemperatur i en vævskultur hætte. Næste, fjerne alle de con A solution, (som kan bevares og genanvendes til fremtidige eksperimenter) og tillade retter at lufttørre helt. NOTER: Retter kan tilberedes i store partier og kan opbevares i op til 6 måneder på et tørt sted som et laboratorium bænk skuffe.</li>
	<li>Tilføje ca. 2 mL frisk celle kultur medier til hvert glas-bund fad. Resuspend S2R + celler skal afprøves af analysen af pipettering cellekulturmedium op og ned, bruge det til at frigøre ethvert løst vedhængende celler.</li>
	<li>Overføre de resuspenderede S2R + celler til de 35-mm glas-bund skåle, som indeholder den friske cellekulturmedium, så de er mellem 50-70% sammenflydende. Kontrollere celle tæthed i vævskultur mikroskop ved fokusering op og ned gennem flere sletterne i cellerne suspenderet i medium til at få et estimat af antallet celler. Bemærk: Gennem trial and error, den passende tæthed af celler for at opnå 50% - 70% confluency kan opnås.</li>
	<li>Tillad cellerne at tillægge de con-A-belagt glas-bund retter i 45-60 min. Bemærk: Fuldt vedlagte S2R + celler vises 'stegt-æg-lignende,' fladtrykte og fase-mørke.</li>
</ol>5. effektivitet Test af tåge-aircondition Medium og cellulære kontraktilitet Assay
<ol><li>Hvis det ønskes, bekræfte udbyttet af tåge-Myc produceret og koncentreret fra S2:Fog-Myc stabil celler linjer af SDS-PAGE og western blotting. Tilføje 10 µL af SDS-holdige prøvebuffer til 10 µL af koncentreret tåge-Myc og kog det i 5 min. følge standard SDS-PAGE og western blotting protokoller og duppes for anti-Myc at bekræfte tåge-Myc produktion.</li>
	<li>Fjern alle skjold og Sang M3 mellemlang fra vedlagte S2R + celler fra trin 4.3 ved forsigtigt pipettering, og Tilføj forsigtigt tilbage 75 µL af frisk skjold og Sang medium til at begrænse mængden af tåge-aircondition medium anvendes.</li>
	<li>Tilføje 75 µL af tåge-aircondition medier til glas del af glas-bund fad fra trin 5.2 til at bringe den samlede mængde til 150 µL i forholdet 1:1 af tåge-aircondition medier til skjold og Sang M3 medier. Bemærk: En samlede volumen af 150-200 µL er nødvendig for at fuldt ud dække glas del af en typisk glas-bund fad; men dette vil afhænge af dimensionerne af glas-bund fad bruges.</li>
	<li>Overvåge kontraktilitet af celler ved fasekonstrastmikroskopi ved hjælp af 20 X eller 40 X forstørrelse for at observere et helt felt af celler. Spore morfologi af cellerne og kigge efter de skiftende mønster af fase mørke og fase lys ruffling vejledende forandringens form. Bemærk: Anvendelse af tåge typisk fører til 30% - 50% af de S2R + celler gennemgår cellulære konstriktion, og efter 10 min, cellerne begynde at slappe af, tilbage til deres glatte kanter, stegt-æg-lignende morfologi.</li>
	<li>Overvåge den cellulære kontraktilitet robusthed. Hvis den celle respons er meget stærk, ved hjælp af en 1:1 ratio af tåge-aircondition medium til frisk skjold og Sang medium, reducere mængden af tåge-aircondition medium til at bevare den koncentrerede tåge-Myc medium for fremtidige eksperimenter. Brug ufortyndet tåge-aircondition medium hvis forholdet 1:1 ikke fører til robust cellulære konstriktion; generelt producerer et forhold på 1:3 nok svar at gennemføre forsøget. Bemærk: Når det passende forholdet tåge-aircondition medium til frisk skjold og Sang medium er etableret pr. givet batch af tåge-aircondition medie, bruge dette forhold for alle andre eksperimenter.</li>
	<li>Overvåge ikke-muskel myosin II dynamics under cellulære kontraktilitet analyse ved hjælp af den stabile S2R + cellelinie der udtrykker normal god landbrugspraksis-mærket lovgivningsmæssige lys kæde (S2R +: Sqh-EGFP).</li>
	<li>Ved hjælp af etablerede forholdet mellem tåge-aircondition medium til frisk skjold og Sang M3 mellemlang fra trin 5,2-5,5, fjerne celle-kulturperler medium med en pipette og tilføje tilbage frisk skjold og Sang medium i glas-delen af glassed-bund fad. Perfuse Fog-aircondition medium på en forudbestemt ratio samtidig erhverve en billedsekvens af levende celler; passe på, ikke flytte den glas-bund fad under perfusion.</li>
</ol>6. fastsættelse og farvning af sammensnøret S2R + celler
<ol><li>Fix S2R + celler ved hjælp af en 10% PARAFORMALDEHYD løsning i PEM buffer (100 mM rør, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6.9). Bemærk: PEM buffer er typisk lavet på 2 x stamopløsning og kan opbevares i flere måneder ved 4 ° C.</li>
	<li>Fjerne cellekulturmedium fra Fog-behandlede S2R + celler af pipettering og straks at ombytte det med 1,5-2,0 mL af 10% PARAFORMALDEHYD løsning. Inkuber i 15 min ved stuetemperatur. Bemærk: Fast celler kan gemmes i fiksering løsning ved 4 ° C for flere dage; Det er imidlertid vigtigt, at de første 15-min fiksering sker ved stuetemperatur før overførsel cellerne til 4 ° C.</li>
	<li>Fjerne 10% PARAFORMALDEHYD løsning af pipettering og bortskaffe dette organisk affald produkt korrekt. Skyl cellerne af forsigtigt pipettering 1,5-2,0 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til 35-mm glas-bund fad. Fjerne den gamle PBS af pipettering og erstatte det med 1,5-2,0 mL frisk PBS 2 x mere til at fjerne resterende fiksering løsning. Bemærk: Det er vigtigt, at cellerne ikke tørre ud fra dette punkt på i protokollen.</li>
	<li>Blokere cellerne med ca. 200 µL af 5% normal ged serum fortyndet i PBS, der er blevet suppleret med 0,1% nonionisk detergent (PBST) i 20 min. ved stuetemperatur. Bemærk: Normalt blokere løsninger indeholder serum, der matcher den organisme, de sekundære antistoffer er rejst i.</li>
	<li>Forberede den primære antistof løsning ved at fortynde det i PBST. Bruge et volumen på ca. 200 µL til helt dække glas del af glas-bund fad.<ol>
<li>Fjern blokering løsningen af pipettering og tilføje den primære antistof løsning direkte til glas-delen af fadet. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur eller, alternativt, inkuberes natten over ved 4 ° C.</li>
		<li>Når inkubering natten over ved 4 ° C, wrap 35-mm glas-bund fad med parafilm at forhindre fordampning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fjerne den primære antistof løsning af pipettering og skyl cellerne af pipettering 1,5-2,0 mL frisk PBS til 35-mm glas-bund fad. Fjerne PBS af pipettering og erstatte det med 1,5-2,0 mL frisk PBS 2 x mere.</li>
	<li>Der fremstilles en opløsning af sekundær antistof ved at fortynde det i PBST. Et rumfang på 200 µL er passende til bare dække glas del af skålen.<ol>
<li>Tilføje sekundær antistof løsning direkte til glas-delen af fadet. Inkuber celler med sekundær antistof løsning i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.</li>
		<li>Wrap 35-mm skål med parafilm hvis inkubering natten over, for at undgå fordampning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fjerne sekundær antistof løsning af pipettering og skyl celler med PBS af pipettering 1,5-2,0 mL frisk PBS til fadet. Fjerne den gamle PBS og erstatte det 2 x mere, efter denne samme procedure.</li>
	<li>Bevare de faste og farvede celler ved at tilføje nok af en anti-fade fluorescerende montering medium til at dække glas del af glas-bund 35-mm parabol.</li>
	<li>Opbevare prøver ved 4 ° C og væk fra lys. Bemærk: Den fluorescerende signal henfalder langsomt over måneder, selvom opbevares korrekt. For de bedste resultater, billede inden for en uge.</li>
</ol>7. imaging og kvantificering af cellulære kontraktilitet analysen
<ol><li>Billede fast S2R + celler ved hjælp af en standard inverteret lys mikroskop med fasekontrast, DIC eller fluorescens imaging funktioner. Bruger 20 X eller 40 X forstørrelse, fange 10-30 side billedfelter celler afhængigt af celle tæthed, med mål at erhverve billeder af 200 eller flere celler pr. betingelse.</li>
	<li>Ved hjælp af en standard celle counter tælle og registrere antallet af kontraherede (fase-mørke, bonneted celler) og noncontracted celler pr. hvert felt, der er fanget. Bemærk: Det er bedst at have to forskere tage uafhængige tællinger af kontrakt og noncontracted celler pr. felt, eller alternativt de samme forsker kan regne den samme billedfelt celler, tre gange, giver mulighed for et gennemsnitligt antal indgået og noncontracted celler pr. felt skal beregnes.</li>
	<li>Forbered flere con-A-belagt glas-bund retter pr. eksperimentelle tilstand som beskrevet i trin 4.2. Pipetteres op og ned cellekulturmedium til dislodge noget løst vedhængende S2R +: Sqh-EGFP celler og plade dem så de er 50% - 70% sammenflydende i 35-mm glas-bund retter. Tillad cellerne til at vedhæfte i 30-45 minutter.</li>
	<li>Billede S2R +: Sqh-EGFP celler live ved hjælp af en spinning-disk, fejede felt Konfokal mikroskop, eller af lys-ark mikroskopi bruger 60 X - 100 X forstørrelse. Fjerne alle skjold og Sang M3 mellemlang fra glas-bund fadet med vedlagte S2R +: Sqh-EGFP celler.<ol>
<li>Perfuse forudbestemt forholdet mellem tåge-Myc konditioneret medium til frisk skjold og Sang M3 mellemlang fra trin 5,2-5,5 direkte på glasset del af glas-bund fad ved hjælp af en pipette, omhyggelig for ikke at forstyrre holdning af parabol på målet. Erhverve billeder til 12-15 min for at fange indledning og fulde sammentrækning af S2R +: Sqh-EGFP celler. Bemærk: Hvis farvning for ikke-muskel myosin eller myosin-pRLC, dannelsen af en stram myosin ring på overfladen af cellerne er også betegnende for kontraktilitet. Hvis imaging S2R +: Sqh-EGFP celler live, den EGFP-tagged RLC vil danne lignende stramt ringe (Se figur 3) vejledende af kontraktilitet. Figur ændringen, der opstår, vil bevirke, at cellerne til "motorhjelm", optage 3D form; flyet af fokus i mikroskop kan skal justeres for at spore denne celle form ændring. Under kontrol RNAi betingelser, typisk 30-50% af cellerne gennemgå konstriktion ved tilsætning af tåge. Vær opmærksom på at nogle RNAi betingelser kan medføre forsnævring i fravær af tåge.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyBase+portals+to+human+disease+research+using+Drosophila+models.">FlyBase portals to human disease research using Drosophila models.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).</li><li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high-throughput+RNA+interference+screens+to+problems+in+cell+and+developmental+biology.">Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology.</a> Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).</li><li>Currie, J. D., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Drosophila+melanogaster+D17-c3+cell+culture+system+to+study+cell+motility.">Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).</li><li>Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+Cytoskeleton+Using+Live+and+Fixed+Drosophila+Tissue+Culture+Cells.">Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells.</a> Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).</li><li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+requirements+for+actin-based+lamella+formation+in+Drosophila+S2+cells.">Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).</li><li>Yi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+reveals+multiple+regulators+of+caspase+activation.">A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).</li><li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection.">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).</li><li>Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inference+of+RhoGAP/GTPase+regulation+using+single-cell+morphological+data+from+a+combinatorial+RNAi+screen.">Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen.</a> Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).</li><li>Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+epithelial+morphogenesis+by+the+G+protein-coupled+receptor+mist+and+its+ligand+fog.">Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog.</a> Science Signaling. 6 (301), 98 (2013).</li><li>Leptin, M., Grunewald, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+changes+during+gastrulation+in+Drosophila.">Cell shape changes during gastrulation in Drosophila.</a> Development. 110 (1), 73-84 (1990).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+movements:+the+logic+and+the+nuts+and+bolts.">Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Martin, A. C., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction:+themes+and+variations+on+a+cellular+mechanism+driving+morphogenesis.">Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis.</a> Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).</li><li>Dawes-Hoang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=folded+gastrulation,+cell+shape+change+and+the+control+of+myosin+localization.">folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization.</a> Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).</li><li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., H&#228;cker, U., Turck, C., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RhoGEF2+associates+with+microtubule+plus+ends+in+an+EB1-dependent+manner.">Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner.</a> Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).</li><li>Coravos, J. S., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+Sarcomere-like+Actomyosin+Contracts+Nonmuscle+Drosophila+Epithelial+Cells.">Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells.</a> Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).</li><li>Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+domain+polarization+localizes+actin-myosin+activity+to+drive+ratchet-like+apical+constriction.">Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).</li><li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abelson+kinase+(Abl)+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila.">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134 (3), 567-578 (2007).</li><li>Manning, A. J., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fog+signaling+pathway:+insights+into+signaling+in+morphogenesis.">The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis.</a> Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).</li><li>Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+G&#945;12/13+exacerbates+apical+area+dependence+of+actomyosin+contractility.">Loss of G&#945;12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).</li><li>Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+myosin+phosphorylation+regulates+contractile+pulses+and+tissue+integrity+during+epithelial+morphogenesis.">Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).</li><li>Parks, S., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gastrulation+gene+concertina+encodes+a+G+alpha-like+protein.">The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein.</a> Cell. 64 (2), 447-458 (1991).</li><li>Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GTPase+and+a+putative+RhoGEF+mediate+a+signaling+pathway+for+the+cell+shape+changes+in+Drosophila+gastrulation.">The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation.</a> Cell. 91 (7), 905-915 (1997).</li><li>Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+cell+signal+encoded+by+the+folded+gastrulation+gene+coordinates+cell+shape+changes+during+Drosophila+gastrulation.">A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation.</a> Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).</li><li>Peters, K. A., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ric-8+interacts+with+the+G&#945;12/13+subunit,+Concertina,+during+activation+of+the+Folded+gastrulation+pathway.">Drosophila Ric-8 interacts with the G&#945;12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).</li><li>Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Control+of+GPCR+Organization+and+Signaling+by+Endocytosis+in+Epithelial+Morphogenesis.">Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis.</a> Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).</li><li>Kerridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+activation+of+Rho1+by+GPCR+signalling+imparts+polarized+myosin+II+activation+during+morphogenesis.">Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).</li><li>Myat, M. M., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+shape+in+the+Drosophila+salivary+gland+is+controlled+by+regulated,+sequential+internalization+of+the+primordia.">Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia.</a> Development. 127 (4), 679-691 (2000).</li><li>Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+signaling+governs+the+cortical+stability+during+apical+constriction+in+Drosophila+gastrulation.">Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation.</a> Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).</li><li>Nikolaidou, K. K., Barrett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rho+GTPase+signaling+pathway+is+used+reiteratively+in+epithelial+folding+and+potentially+selects+the+outcome+of+Rho+activation.">A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation.</a> Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).</li><li>Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+line+of+Drosophila+Schneider+S2+cells+that+respond+to+wingless+signaling.">Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling.</a> Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).</li><li>Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+GTPase+inhibition+organizes+contraction+during+epithelial+morphogenesis.">RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for en celle-baserede kontraktilitet analyse ved hjælp af en Drosophila vævskultur cellelinje (S2R + celler), som gennemgår ikke-muskel myosin II konstriktion som en reaktion på tåge signalering. Denne analyse er nyttige for efterforskningen tåge pathway, samt mekanismer, der regulerer ikke-muskel myosin II kontraktilitet.
Dyrkning af celle overvejelser: De betingelser, under hvilke S2R + celler bevares er afgørende for at opnå pålidelige oplysninger fra denne analyse. Når du planlægger at udføre kontraktilitet assay, det bedst at opretholde S2R + celler i skjold og Sang M3 insekt medium. Mens S2R + celler kan trives i andre insekt celle kultur medier (f.eks.SF900 eller Schneiders insekt medium), de ofte mister deres lydhørhed at tåge. S2R + celler, der har en høj passage nummer, generelt mere end 20-25 passager, begynder at miste følsomhed til RNAi. Det er bedst at bruge tidlige-passage celler for alle eksperimenter. Et andet vigtigt aspekt at RNAi udtynding eksperimenter er at vælge passende kontrol. Fælles negativ kontrol omfatter dsRNA rettet mod EGFP eller pBlueScript, heller ikke af som har homologi at flyve genomet. Målretning proteiner i tåge pathway (Rho, Rok, etc.), som, når opbrugt, forhindrer aktivering af ikke-muskel myosin kontraktilitet, er også nyttige kontrol. S2:Fog-Myc celler kan opretholdes i en alternativ cellekulturmedium såsom SF900 suppleret med 100 enheder/mL af penicillin, 100 µg/mL streptomycin, og 0,25 amphotericin B. Bemærk at FBS er ikke påkrævet, når dyrkning af celler i SF900. Celle tæthed er også en vigtig komponent til alle aspekter af Drosophila vævskultur celler. I modsætning til pattedyr vævskultur celler, Drosophila-afledte vævskultur celler trives bedst under højere celle tætheder (tætheder ikke er lavere end 5 x 105 celler/mL). Når du udfører denne analyse, dog det afgørende, at cellerne ikke er belagt på con-A-belagt glas-bund retter over 80% sammenløb, som kvantificering af kontraherede versus ikke-kontraherede celler vil blive yderst kedelig.
Kritiske aspekter og Alternative tilgange til cellulære kontraktilitet Assay: Produktionen af tåge, ligand, der udløser ikke-muskel myosin II kontraktilitet, er et nøgleelement i denne analyse. Tåge -genet koder et protein af 730 aminosyrer med en forventet molekylvægt af ~ 78 kDa26. Hydropatianalyse analyse afslørede en strækning af 12 hydrofobe rester på Fogs amino-terminus, som kunne fungere som en sekretion signal sekvensen. Derudover indeholder de kodende sekvens også flere steder for potentielle N - og O-linked glykosylering, yderligere tyder på tåge er en udskilles protein26. Til støtte for dette, var tåge lokaliseret til sekretoriske vesikler i formodede epidermale celler under apikale konstriktion16. Tåge-Myc udtryk er fremkaldt ved tilsætning af kobber sulfat til mediet, og antistoffer mod tåge eller Myc anerkendt en 150-kD protein fra næringssubstratet høstet fra induceret kulturer, men ikke fra induceret medier fra S2 celler mangler tåge-Myc konstruktion. Denne molekylvægt var højere end den forudsagte 80-kD molekylvægt af tåge og tyder på, at den sekretoriske celler, S2 kan glycosylate protein før exocytose. På grund af den potentielle variabilitet i tåge rensning er det tilrådeligt at bruge det samme parti af tåge-aircondition medier for alle eksperimenter. At gøre op store partier af koncentreret tåge-Myc media vil hjælpe med at opretholde sammenhæng i hele runder af eksperimenter.
Denne analyse succes afhænger også trygt at identificere celler, der har undergået konstriktion. Mens sammensnøret celler kan observeres ved Fluorescens mikroskopi, ved farvning for actin eller ikke-muskel myosin II, er den mest pålidelige måde at identificere og kvantificere sammensnøret celler gennem fasekontrast eller DIC mikroskopi. Nøjagtig tæller kan opnås ved hjælp af 20 X - 40 X forstørrelse på de fleste standard lys mikroskoper. Selv om den protokol, der er skrevet her bruger glas-bund retter, kan analysen også udføres ved hjælp af standard 1,5 glas coverslips belagt med con A. Tilsætning af tåge kan gøres i 35 mm af vævskultur på en coverslip placeret på parafilm, for at begrænse mængden af tåge bruges for hvert assay. Kvaliteten af fiksering er et afgørende element i analysen, som dårligt fast celler kan føre til falske positiver. Ved hjælp af friske fiksering løsning og sørge for vil cellerne aldrig tør engang fast føre til mere pålidelige resultater. Endelig er det vigtigt at tælle et stort antal celler. Typisk, kun 30% - 50% af ubehandlet eller kontrol RNAi-behandlede celler snøre efter perfusion af tåge. Der er imidlertid en basal grad af forsnævring, der opstår i S2R + celler, så et stort antal celler er nødvendige for at sikre, at enhver ændring i brøkdel af sammensnøret celler skyldes behandlinger. Desuden kan nedbrydning af nogle proteiner involveret i reguleringen af ikke-muskel myosin II kontraktilitet føre til hyper-kontraktilitet, selv i mangel af tåge. De data præsenteres her er fra over 3.600 celler, der blev talt i tre successive RNAi behandlinger ved hjælp af det samme parti af tåge-aircondition medier.
Anvendelser af cellulære kontraktilitet Assay: Denne kontraktilitet assay, når kombineret med RNAi screening-metoder, tilbyder et kraftfuldt system for at studere celle signalering, morfogenese og cellulære kontraktilitet. Det har tidligere været brugt til at identificere en af to tåge Co receptorer21. En målrettet skærm af 138 G-protein-koblede receptorer (GPCRs) er forarmet af RNAi i S2R + celler, og dens evne til at reagere på tåge var analyseres som beskrevet i den protokol, der præsenteres her. Af de 138 GPCRs, en enkelt, blev tidligere uncharacterized gen, nu kendt som tåge, afsløret. Yderligere undersøgelse funktionen af tåge demonstreret at ikke blot var det nødvendigt for tåge-induceret cellulære kontraktilitet i S2R + celler, men det var også vigtigt for gastrulation i at udvikle Drosophila21. Desuden, denne analyse blev brugt til at vise, at Ric-8, en ikke-kanoniske GEF, er også en komponent i tågen signalering vej27. En række epistasis RNAi eksperimenter kombineret med kontraktilitet Analysen viste, at Ric-8 interagerer med Gα12/13 subunit Cta og funktioner til at lokalisere det inden for den celle, som er kritiske for tåge-induceret cellulære kontraktilitet31 .
Drosophila vævskultur er velegnet til nybegyndere, som cellerne er let vedligeholdes ved stuetemperatur, kræver ikke CO2 eller buffered cellekulturmedium og er robust, så længe korrekt celle kultur tætheder vedligeholdes. Cellulære kontraktilitet analysen blev med held udført af laboratoriet del af en bachelor celle biologi kursus, hvor studerende havde lidt eller ingen erfaring med dyrkningsbaserede celler eller mikroskopi. Den cellulære kontraktilitet assay præsenteres her repræsenterer et stærkt, celle-baseret værktøj, der kan være ansat i gen discovery, eller for at afhøre tågen signalering pathway, hjælper os til bedre forstå udviklingsmæssige processer, såsom apikale konstriktion og ikke-muskel myosin II kontraktilitet, i almindelighed.

Undersøgelser af embryogenese udført med genetiske modelorganismer har vist sig uvurderlig for vores forståelse af, hvordan celler er samlet ind i væv. Undersøgelser af Drosophila melanogaster, især har ført til identifikation af centrale gener og biologiske principper, der direkte morfogenese og udvikling af organismer fra befrugtning til voksenalderen1,2 , 3. parallelt med den genetiske forskning udført med Drosophilakulturperler cellelinjer afledt af bananfluen væv er også dukket op som et kraftfuldt system til at løse en bred vifte af molekylære og celle biologiske spørgsmål4, 5 , 6. drosophila vævskultur celler har minimal behov for vedligeholdelse, da de er kulturperler ved stuetemperatur og uden CO2. Som sådan, de er indstillet til høj opløsning billeder, og de har en høj grad af følsomhed over for gen hæmning af RNAi6,7. Mange grupper har brugt Drosophila vævskultur celler som et redskab til at opdage gener involveret i celle form, cytoskeletal dynamics, levedygtighed, fagocytose og signaltransduktion veje4,8, 9,10,11. Når de anvendes som model ved siden af hele dyret, tilbyder kulturperler Drosophila cellelinjer en række meget komplementære metoder, at fremskynde identifikationen af molekyler vigtige for udviklingen og skabe en ramme til at bestemme deres mekanistiske roller12. Her, beskriver vi en celle-baseret analyse for at studere de signaling veje, der udløser apikale konstriktion via foldet gastrulation (tåge) vej13,14. Denne celle-baserede kontraktilitet assay gør det muligt for forskere at undersøge begge tågen signalering pathway og de molekylære mekanismer, der regulerer ikke-muskel myosin II kontraktilitet.
Gastrulation af de tidlige Drosophila embryo er blevet studeret i mange år som en genetiske model for den epitelial morfogenese og cellulære overgangen fra epitelial mesenchymale celler identitet. En af de vigtigste begivenheder i gastrulation er morfogenese af en delmængde af epitelceller langs den embryonale ventrale midterlinjen fra kolonneformat til pyramide i figur15,16,17,18. Denne enkle celle figur ændre resultater i en internalisering af de formodede mesodermale celler og er drevet af den motorisk aktivitet af ikke-muskel myosin II snærende actin netværk16,19,20. Årtier af genetisk forskning har identificeret de molekylære komponenter af denne vej og sekventielt har placeret dem i følgende rækkefølge: 1) tåge udskilles fra det apikale domæne af epitelceller på den ventrale midterlinjen; 2) tåge binder til G-protein-koblet Co receptorer, tåge og Smog, og signaler gennem et heterotrimeric G-protein kompleks, der indeholder Gα12/13 subunit harmonika (Cta), som er chaperoned af ikke-kanoniske GEF Ric-8; 3) Cta aktiveres en guanin nukleotid udveksling faktor, RhoGEF2, som igen aktiverer de små G-protein Rho1; 4) Rho1 aktiveres Rho kinase (Rok); 5) Rok aktiveres ikke-muskel myosin II kontraktilitet på den apikale domæne gennem fosforylering af den lovgivningsmæssige lys kæde (RLC), herigennem producerer apikale konstriktion (figur 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutationer i flere af disse komponenter forstyrre den normale gastrulation og andre morfogenetiske bevægelser, herunder dannelsen af wing disc og spytkirtler, der angiver, at denne sti bruges på flere stadier af Drosophila embryogenese30,31,32. Tåge pathway er en af de bedst undersøgte modeller for epitelial forme og har givet vigtige indsigt i hvordan væv-niveau morfogenese reguleres fra gen transskription til cytoskeleton-drevet celle bevægelser14,15 ,21.
Vi udviklede en celle-baserede kontraktilitet assay, der sammenfatter mange af de cellulære svar nedstrøms af tåge, der konstateres i udvikle flyve embryoner17. Vi konstruerede en stabil S2 cellelinie, der udtrykker tåge markeret på sine C-terminus med myc under kontrol af en inducerbar metallothionine promotor, der kan høstes efter tilsætning af kobber sulfat (CuSO4) til medium. Når tågen-aircondition medier anvendes ectopically til S2 receptorer + (S2R +) celler, som er en underlinje S2 celler udmærker sig ved deres differentiel ekspression af receptorer som Frizzled og integrin underenheder, cellerne undergår en omorganisering af de cytoskelettet meget minder om apikale konstriktion12,17,27,33. Disse ændringer kan observeres ved fasekonstrastmikroskopi i hvilke Fog behandling fører til udseendet af fase-mørke flæser vejledende af en radial stigning i ikke-muskel myosin II kontraktilitet eller ved Fluorescens mikroskopi hvor tågen behandling fører til den dannelsen af ikke-muskel myosin II ringe i celler, der udtrykker EGFP-tagged RLC34. Disse ringe indeholder en myosin-fosforyleret regulerende lys kæde (pRLC) ses via immunfarvning23,34,35. Denne tåge-induceret svar kræves Cta, RhoGEF2, Rho og Rok; således, ved hjælp af rekombinant tåge-Myc og S2R + celler, har vi etableret et middel til at undersøge tåge-induceret konstriktion i et væv-kultur-baseret system24,25,34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1157">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td style="width:123px;">150</td>
			<td style="width:496px;">cell culture line, undergoes apical constriciton</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2:Fog-myc cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>218</td>
			<td>cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ :Sqh-EGFP cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>196</td>
			<td>cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Shield and Sang M3</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3652</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">SF900 insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>12658019</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Schneider&#8217;s insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
			<td>antimicrobial/antifugal media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:223px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">150710</td>
			<td>used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass bottom plates</td>
			<td style="width:223px;">Maktek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-10</td>
			<td>used for assay and for fixing and staining cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">2940-225</td>
			<td>alternative to glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Protein concentrators</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC903008</td>
			<td>30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:317px;">25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-204,25-206,25-208,25-210</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6-well and 12-well tissue culture dishes</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-105, 25-106</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Flourescent mounting medium</td>
			<td style="width:223px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S3023</td>
			<td>to preserve fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">32% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">15714-S</td>
			<td>used to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pipes</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19240</td>
			<td>used in PEM buffer for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Anti-Myc Antibody</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Hybirdoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">cat# 9E10</td>
			<td>used to dectect Fog-Myc&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">PhosphoSerine-19 antibody</td>
			<td style="width:223px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:123px;">3671</td>
			<td>antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">488-Phalloidin, 568-Phalloidin</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A12379, A12380</td>
			<td>to stain for f-actin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hawk-VT multi-point array scanning confocal system&#160;</td>
			<td style="width:223px;">VisiTech International</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Eclipse TE300 Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells

Vi har udviklet en celle-baserede analyse ved hjælp af Drosophila celler der sammenfatter apikale konstriktion initieret af foldet gastrulation (tåge), en udskilles epitelial morphogen. I denne analyse bruges tåge som en agonist til aktivere Rho gennem en signal kaskade, der omfatter en G-protein-koblet receptor (tåge), en Gα12/13 protein (harmonika/Cta) og en PDZ-domæne-holdige guanin nukleotid udveksling faktor (RhoGEF2). Tåge signalering resultater i den hurtige og dramatiske reorganisering af actin cytoskelettet til at danne en kontraktile pung streng. Opløselige tåge er indsamlet fra en stabil cellelinie og anvendes ectopically til S2R + celler, førende til morfologiske ændringer som apikale konstriktion, en proces observeret under udviklingsmæssige processer som gastrulation. Denne analyse er indstillet til høj overførselshastighed screening og ved hjælp af RNAi, kan lette identifikation af yderligere gener involveret i denne vej.

S2 og S2:Fog-Myc celler blev dyrket til nær sammenflydende betingelser i et 150 cm2 vævskultur kolbe og blev behandlet med 25-75 µM CuSO4 over en periode på 24-48 timer til at fremkalde udtryk for tåge-Myc (figur 2). Prøver fra S2 celler (fig. 2A) og S2:Fog-Myc celler (figur 2B) blev fjernet og tåge-Myc produktion blev overvåget af vestlige skamplet. Som forventet lykkedes os at opdage tåge-Myc i medier høstet fra S2 celler under alle forhold. Men vi registrere tåge i medier høstet fra S2:Fog-Myc stabil cellelinie så tidligt som i 24 timer efter induktion med 75 µM CuSO4. S2R + celler knyttet til con-A-belagt glas-bund retter at udtrykke en EGFP-mærket lovgivningsmæssige lys kæde (normal god landbrugspraksis-RLC) af ikke-muskel myosin II (tal 3A og 3B). Live-celle imaging blev udført på en inverteret mikroskop udstyret med en 100 X / 1.4 NA mål linse under perfusion af tåge-aircondition medier. Cirka 5 minutter efter behandling med tåge-Myc, RLC dannet ringe tegn på ikke-muskel myosin II konstriktion. Disse ringe kan observeres gennem immunfarvning S2R + celler med et antistof, der er rejst mod en syntetisk phosphopeptide svarende til restkoncentrationer omkring Ser19 af menneskelige myosin RLC (tal 4A og 4B). Dette antistof cross-reacts med Drosophila RLC.
Her har vi et repræsentativt eksempel på cellulære kontraktilitet analysen efter en 7-dages behandling af celler med kontrol RNAi og dsRNA mod Rho1 (tal 5A - 5E). S2R + celler var belagt på con-A-belagt glas-bund retter og behandlet med tåge-aircondition (+ tåge) medier eller kontrol medier (-tåge). Antallet af kontraherede celler blev derefter kvantificeret efter fiksation. Fase-tætte flæser vejledende af konstriktion var fremtrædende i kontrol forarmet celler behandles med tåge-aircondition medier (figur 5B). I figur 5Cer Rho-forarmet celler behandles med S2-aircondition medium et typisk eksempel på glatte kanter, stegt-æg-lignende morfologi. Bemærk at Rho spiller en rolle i tåge signalvejen og cytokinesis; således undlader Rho-forarmet celler ofte at korrekt Divider, fører til en stigning i Cellestørrelse og Ploidi. Behandling af kontrol forarmet celler med tåge-aircondition media typisk fører til 30% - 50% af celler gennemgår konstriktion, der henviser til, at vi ikke kunnet konstatere betydelige konstriktion i Rho-forarmet celler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig1.jpg"> Figur 1:formodede tågen signalering pathway. I fravær af tåge, Gα12/13 subunit, harmonika (Cta), sammen med partnerne bindende Gϒ og Gβ, er inaktive og forbundet med fælles receptorer tåge og Smog. Ric-8 chaperoner Cta og regulerer dens subcellulært lokalisering. Ved tåge bindende, Cta disassociates fra Gϒ, og Gβ rekrutter RhoGEF2 til cellemembranen, hvor det katalyserer udveksling af BNP for GTP i den lille GTPase Rho1. GTP-bundne Rho1, nu aktiv, aktiveres Rho Kinase (Rok), som phosphorylates den RLC af ikke-muskel myosin, fører til aktivering og efterfølgende cellulære kontraktilitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig2.jpg"> Figur 2 : Tidsforløb tåge-Myc produktionens. Disse paneler viser cellekulturmedium høstet fra en i nærheden af 100% sammenflydende kolbe af (A) kontrol S2 celler eller (B) S2:Fog-Myc stabil celler. Cellerne blev behandlet med 25-75 µM CuSO4 over en periode på 24-48 timer. Cellekulturmedium blev indsamlet og udarbejdet for SDS-PAGE og western blotting. Tåge-Myc blev opdaget af en anti-Myc antistof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig3.jpg"> Figur 3 : Live-celle billeddannelse af tåge-induceret konstriktion. Stabil S2R + cellelinjer udtrykker EGFP-tagged RLC af ikke-muskel myosin II blev afbildet af fejede felt Konfokal mikroskopi under perfusion af tåge-aircondition medier. Tid er vist i minutter og sekunder. (A) dette panel viser et billede af en fokalplan tæt på celle-coverslip interface på tidspunkt 0:00 før perfusion af tåge-Myc. (B) dette panel viser en tidsserie (0:30-10:00) af billeder taget på en fokalplan nær toppen af cellen. De hvide pile angiver reorganisering af ikke-muskel myosin II som angivet af EGFP-RLC i kontraktile ringe under konstriktion. Skalalinjen er 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig4.jpg"> Figur 4 : Fosforyleret RLC lokaliserer til kontraktile ringe efter induktion af konstriktion af tåge-Myc. S2R + celler var fast og farves til aktin ved hjælp af phalloidin (rød), fosforyleres RLC ved hjælp af en phosphoserine-19 antistof (grøn) og DAPI (DNA, blå), efter behandling med (A) kontrol eller (B) tåge-Myc-aircondition medier. Bemærk reorganisering af fosforyleres RLC i ringe efter tilsætning af tåge-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig5.jpg"> Figur 5 : Repræsentative kvantitativ bestemmelse af tåge-induceret cellulære kontraktilitet assay. S2R + celler blev behandlet med (A og B) kontrol RNAi eller (C og D) dsRNA mod det lille GTPase Rho1 i 7 dage. Efter dette tidspunkt, cellerne var belagt på con-A-belagt glas-bund retter og blev behandlet med (A og C) kontrol medier eller (B og D) tåge-Myc-aircondition medier. Skala bar repræsenterer 10 µm. (E) A scatter plot angiver middelværdi og 95%-konfidensintervallerne for brøkdel af kontraherede celler pr. betingelse. Enkelte punkter repræsenterer brøkdel af kontraherede celler pr. synsfelt på 40 X forstørrelse (10-120 celler pr. felt) og tallene i parentes angiver det samlede antal celler tælles for både aftalte og ikke-kontraherede celler over tre separate RNAi eksperimenter. Stjerner betegne en statistisk signifikant forskel mellem RNAi - og tåge-behandlet betingelser, som bestemmes af en-vejs ANOVA (p < 0,0001) med Tukeys flere sammenligning post hoc analyser. Bemærk at der var ingen statistisk signifikant forskel (n.s.) mellem Rho1 RNAi-behandlede prøver behandlet med kontrol eller med tåge-Myc-aircondition medier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Her beskriver vi en kontraktilitet analyse ved hjælp af Drosophila S2R + celler. Anvendelsen af en udefrakommende ligand, foldede gastrulation (tåge), fører til aktivering af tågen signalering pathway og cellulære kontraktilitet. Denne analyse kan bruges til at undersøge regulering af cellulære kontraktilitet proteiner i tågen signalering pathway.

En celle-baserede analyse at undersøge ikke-muskel Myosin II kontraktilitet via foldet gastrulation signalering Pathway i Drosophila S2R + celler

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

This method can help answer key questions in the fields of cell and developmental biology, such as which proteins are involved in the regulation of non-muscle myosin-II contractility and which proteins are key in the folded gastrulation or fog-signaling pathway. The main advantage of this technique is that, coupled with RNEI depletion, the cellular-contractility assay can be used as a tool for gene discovery for proteins involved in fog signaling and non-muscle myosin-II contractility. The implications of this technique extend toward our basic understanding of development.Non-muscle myosin-II contractility is universally critical to cell-shape change, or morphogenesis, that occurs during development. Though this method can provide insight into the development of drosophila, it can also be applied to other systems, because it is critical to a whole host of other cellular functions. Generally, individuals new to this method will struggle because getting correct cell density and recognizing the difference between contracted and non-contracted cells can be difficult.To begin, coat the glass portion of 35-millimeter glass-bottomed dishes with 200 microliters of con-A solution. Incubate the dishes for approximately two minutes at room temperature in a tissue-culture hood. After this, remove the con-A solution, and allow the dishes to air-dry completely.Add approximately two milliliters of fresh cell-culture media to each of the glass-bottomed dishes. Then, resuspend the S2R+cells by pipetting the cell-culture medium up and down. Transfer the resuspended S2R+cells to the prepared glass-bottomed dishes.Then, check the cell density under a tissue-culture microscope by focusing up and down through multiple planes of cells. Establishing the initial cell density is critical. Too few cells will make it difficult to quantify, and too many cells will make quantification tedious.Use the microscope to focus up and down the dish to estimate the number of cells. Next, allow the cells to attach to the con-A-coated glass-bottomed dishes for 45 to 60 minutes. First, gently pipette to remove all of the cell-culture medium from the attached S2R+cells.Then, carefully add back 75 microliters of fresh medium. Next, add 75 microliters of fog-conditioned media to the glass portion of the dish. Using phase-contrast microscopy at 20 times or 40 times magnification, monitor the contractility of an entire field of cells.Track the morphology of the cells for the alternating pattern of phase dark-and-light ruffling, characteristic of shape change. Correctly identifying cells undergoing contraction can be hard the first time. As the cells contract, phase dark and light ruffles will form, making the cell appear like a starburst.Fix the S2R+cells with a 10%paraformaldehyde solution. Then, pipette to remove the cell-culture medium from the fog-treated S2R+cells, and replace it with 1.5 to two milliliters of the paraformaldehyde solution. Incubate both the S2R+cells and the fog-treated S2R+cells for 15 minutes at room temperature.Next, use a pipette to remove the paraformaldehyde solution, and dispose of the waste properly. Then, rinse the cells with PBS three times to remove any residual fixation solution. Block the cells with 200 microliters of 5%normal goat serum in PBS supplemented with 0.1%PBST for 20 minutes at room temperature.Next, dilute the primary antibody in PBST, using a volume of approximately 200 microliters to completely cover the glass portion of the dish. Use a pipette to remove the blocking solution, and add the primary antibody solution directly to the glass portion of the dish. Then, incubate for one hour at room temperature.After this, use a pipette to remove the primary antibody solution, and rinse the cells with fresh PBS three times. To prepare the secondary antibody solution, dilute the secondary antibody in PBST. Then, add the secondary antibody solution directly to the glass portion of the dish.Incubate the dish for one hour at room temperature. After this, use a pipette to remove the secondary antibody solution, and rinse the cells with fresh PBS three times. Then, add sufficient anti-fade fluorescent mounting medium to cover the glass portion of the dish.Store the samples at four degrees Celsius away from any light. First, use 20 times or 40 times magnification to capture 10 to 30 non-overlapping image fields of the fixed cells. Finally, use a standard cell counter to count and record the number of contracted and non-contracted cells in each of the captured fields.Using this protocol, S2 and S2 fog-myc cells were grown and treated with copper sulfate to induce the expression of fog-myc. Unsurprisingly, fog-myc was not detected in the S2 cells under any conditions. However, fog was detected in media harvested from the S2 fog-myc-stable cell line as early as 24 hours after induction with copper sulfate.Approximately five minutes after treatment with fog-myc, the RLC formed rings indicative of non-muscle myosin-II constriction. In a representative cellular-contractility assay, the phase-dense ruffles indicative of constriction were prominent in control-depleted cells treated with fog-conditioned media. Rho-depleted cells treated with S2-conditioned medium demonstrated typical smooth-edged fried-egg-like morphology.While attempting this procedure, it's important to remember time and the quality fixation is important. After 10 minutes, cells begin to relax, so the cells should be fixed before this time. Poor fixation conditions can lead to the false positives.Using this assay, researchers identified mist, one of the two fog coreceptors. This assay was also used to get a better understanding of the role of rigate during fog signaling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells