Dette arbejde blev finansieret af en igangsætter tilskud fra Det Europæiske Forskningsråd (637304), en Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), og af KN-Bio innovationer.

<ol>
	<li>Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture+Models+for+the+Investigation+of+Hepatitis+B+and+D+Virus+Infection.">Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li><li>Elaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+the+dedifferentiation+process+of+isolated+hepatocytes+and+their+cultures.">Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures.</a> Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).</li><li>Konig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+bile+acid+transporter+and+hepatitis+B+virus+receptor+Na+/taurocholate+cotransporting+polypeptide+(NTCP)+in+hepatocytes.">Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).</li><li>Ortega-Prieto, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+microfluidic+liver+cultures+as+a+physiological+preclinical+tool+for+hepatitis+B+virus+infection.">3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection.</a> Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).</li><li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+cccDNA+in+HBV+Maintenance.">The Role of cccDNA in HBV Maintenance.</a> Viruses. 9 (6), (2017).</li><li>Guo, J. T., Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+function+of+hepatitis+B+virus+cccDNA:+Implications+for+the+development+of+cccDNA-targeting+antiviral+therapeutics.">Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics.</a> Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).</li><li>Lucifora, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+antiviral+properties+of+TLR+ligands+against+HBV+replication+in+immune-competent+hepatocytes.">Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5390 (2018).</li><li>Hosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+Virus+Activates+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription+3+Supporting+Hepatocyte+Survival+and+Virus+Replication.">Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+human+liver+scaffolds+for+functional+tissue+engineering+by+high+shear+stress+oscillation-decellularization.">Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5534 (2017).</li><li>Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+promote+survival,+proliferation,+and+maintenance+of+differentiation+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+vitro.">Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).</li><li>Hwa, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+survive+without+exogenous+VEGF+in+3D+perfused+co-cultures+with+hepatocytes.">Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes.</a> The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).</li><li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development.">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li><li>March, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+coculture+of+primary+human+hepatocytes+and+supportive+cells+for+the+study+of+hepatotropic+pathogens.">Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).</li><li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury,+liver+function+and+disease.">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187 (2016).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+liver.">Engineering liver.</a> Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).</li><li>Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfused+multiwell+plate+for+3D+liver+tissue+engineering.">Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering.</a> Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Udfordringer i at opretholde langsigtet kulturer af PHH har drevet udviklingen af flere kultur modeller med øget funktionalitet og levetid, hver udstiller differential fordele og ulemper. Det er nu almindeligt anerkendt, at statiske 2D kulturer af PHH efterligne visse aspekter af hepatocyt biologi for meget begrænsede mængder af tid. Således micropatterned cocultures12,13, klumpformet kulturer14,15, og 3D leveren-on-a-chip kulturer16,17 erstatter hurtigt disse mere grundlæggende systemer. Især når man studerer smitsomme sygdomme, som har coevolved med deres vært at udnytte specifikke microenvironments, er kravet om at give fysiologiske miljøer baseret på de ofte udfordrende karakter af dyrkning menneske-tropic smitsomme sygdomme, herunder hepatitis C virus, HBV og malaria.
Den mest kritiske trin i udførelsen af 3D leveren-on-a-chip kulturer er kvaliteten af de først indkøbte primære celletyper. Disse celler bør testes for deres overholdelse af kapacitet og kun plateable PHH masser bør anvendes for at sikre vellykket væv dannelse og kultur generation. Selvom frisk isolerede PHH kan bruges, deres kryopræservering er normalt kompliceret og kræver særlige sats-kontrollerede frysere.
I modsætning til konventionelle statisk 2D kulturer, vært genetiske baggrund er ubetydelig med hensyn til modtagelighed for HBV infektion, og alle dermed langt testede hepatocyt donorer er stand til at etablere HBV infektion4.
Selvom patienten-afledte HBV etablerer infektioner af 3D kulturer, er det nødvendigt at udnytte PIND-fældet og saccharose pude-renset HBV når som helst bruge inducerbar HBV producent celle linjer for generation af viral inocula. Celle kultur analysere direkte anvendes på 3D leveren-on-a-chip kulturer, enten gennem tilstedeværelsen af hæmmende faktorer eller på grund af inkompatibilitet nuværende vækstfaktorer med hepatocytter, medfører ikke let infektion. Desuden, når du vælger patient-afledte virale inocula, bør kun serum anvendes, da plasma uundgåeligt koagulerer og træsko mikrofluid omsætning af kultur-platformen.
Uanset den virale inokulum bruges, er sikre cellulære levedygtighed og differentiering, samt at sikre fuldstændig fjernelse af den oprindelige HBV inokulum, nøglen til vellykket langsigtet infektion undersøgelser. Den mest bekvemme måde at gøre dette er prøveudtagning kulturer efter fjernelse af den virale inokulum, samt måling af human serum albumin niveauer i hele perioden kultur. Bemærk, på samme måde for alle andre beskrevet platforme, HBV infektion, når etableret, spredes ikke let til ikke-inficerede celler. Den underliggende mekanisme for dette er fortsat undvigende, da HBV infektion in vivo let inficerer størstedelen af hepatocytter inden for leveren.
Med hensyn til cocultures af PHH og Kupffer celler er det tilrådeligt at udføre masse tests af Kupffer celler til at evaluere IL6 og TNFα sekretion i response på LPS stimulation, da ikke alle kommercielt tilgængelige Kupffer celledonorer har en lige lydhørhed.
Vigtigere, for alle medicinske behandlingsmetoder eller oprindelige infektion af kulturer med HBV, skal det samlede volumen af brønden (1,4 mL), samt for fra mikrofluid kanal (0,2 mL), tages i betragtning ved beregningen af narkotika eller inokulum koncentrationer. For at sikre korrekt dosering, er en vask skridt med medium indeholdende HBV eller narkotika udført for at prime mikrofluid kanalen.
Den anvendte platform udnytter 600.000 PHH pr. brønd, som sikrer flerlaget hepatocytter inden for stilladser. Selv om celle nummer kan varieres, sikrer den valgte celle koncentration optimale resultater. Formatet plade holder ialt 12 stilladser, som kan opgraderes til 36 stilladser. Men på grund af mikrofluid krav, skalere op til højere godt numre er ikke muligt at dato.
Brug af disse tilgange, kan kulturer opretholdes med optimal celle ydeevne i mindst 40 dage, som hidtil, giver hidtil usete muligheder for at evaluere nye lægemiddelkandidater, samt undersøge de komplekse samspil mellem forskellige hepatiske celle befolkninger under HBV infektion.

Studiet af HBV er blevet kompliceret af den fattige modtagelighed for kultur systemer, der kræver flere hundreder til tusinder af HBV genom kopier pr. celle at indlede infektion1. Endvidere, primære humane hepatocytter er generelt yderst skrøbelige og dedifferentiate hurtigt under konventionelle kulturer2. Dette skyldes primært, at de flade og hård plast overflader ikke efterligne de naturlige ekstracellulære miljøer fundet inden for leveren og den generelle mangel på iltning af kulturer i mangel af mikrofluid omsætning. Konventionelle statisk hepatocyt kulturer på kollagen-belagte plader hurtigt dedifferentiate og mister deres følsomhed over for HBV infektion3. Her beskriver vi set-up og infektion af PHH vokset i 3D leveren-on-a-chip kulturer, som er meget fordelagtige over konventionel 2D statisk PHH kulturer på kollagen-belagte plader på grund af deres udvidede metaboliske og funktionel kompetence, lette langsigtet kulturer af mindst 40 dage4. I dette system, PHH seedede på kollagen-belagt stilladser, der er konstant perfunderet med vækstmedium til at levere ilt og næringsstoffer til cellerne. Selv om alternativ kultur systemer til PHH baseret på komplekse cocultures af murine fibroblaster eller 3D vækst i spheroids er blevet valideret og er modtagelige for HBV-infektion ved hjælp af multiplicities af infektion af 500 genom ækvivalenter (GE) af HBV pr celle, 3D leveren-on-a-chip kulturer forbliver den eneste in vitro-modelsystem modtagelige til 0,05 GE af HBV pr. celle4. Dette understøttet desuden af nødvendigheden af at bruge høje koncentrationer af dimethylsulfoxid (DMSO) og polyethylenglycol (PEG) for at etablere HBV infektion i disse kulturer, der er overflødige for infektion af 3D leveren-on-a-chip kultur systemer 4. blandt de store kendetegnende for HBV-infektion er cccDNA-pool, der fungerer som den transcriptional skabelon for alle de novo-produceret virioner5,6. Selv om cccDNA kan påvises i konventionelle hepatocyt kulturer7,8, det er fortsat uklart, om regulering af cccDNA og eventuelle terapeutiske tilgange med henblik på dens fjernelse er sammenfattet i delvis eller helt dedifferentiated hepatocytter. Vi har vist, at cccDNA er funktionelt dannet i 3D leveren-on-a-chip kulturer, reagerer på fysiologiske stimuli og kan rettes ved at blande sig med tilgængeligheden af det transkriptionel maskiner til cccDNA genom4.
Værten svar til HBV infektion i 3D leveren-on-a-chip efterligner dem observeret i HBV-inficerede patienter, muliggør identifikation af biomarkører for infektion, samt terapeutiske succes. Blandt de unikke funktioner i leveren-on-a-chip kulturer er evnen til at vurdere langsigtede vært svar mellem PHH og andre nonparenchymal celler i leveren, herunder Kupffer celler4, Stjernehus celler9og leveren sinusformet endotelceller10,11. Dette giver en unik mulighed for at evaluere celle/celle interaktioner i en kompleks 3D mikromiljø.
Derudover letter perioden udvidet kultur af denne platform evaluering af sekventielle lægemiddelsbehandlinger og deres indvirkning på HBV persistens, som ikke er muligt ved hjælp af konventionelle hepatocyt kultur systemer.
Denne protokol beskriver hvordan 3D leveren-on-a-chip kulturer er genereret, enten til monokulturer af PHH eller til cocultures af PHH med Kupffer celler. Derudover beskriver vi produktion af renset HBV for lav mangfoldighed af infektion undersøgelser, samt den efterfølgende analyse af værten og viral svar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Medium, no phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A12176-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Thaw Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>CM7500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>CM3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Hepatocyte Maintenance Supplements</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>CM4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12491023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12106C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T3258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>SO389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate anhydrous</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>451614-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid, 99.999%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagent&#160;Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits/Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile membrane</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip Perfusion cell culture plate</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip culture plate lid</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile round filter paper</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell attachment scaffold</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plunger</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy blood &#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Magnetic Luminex assay</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1048147</td>
			<td>Containing RNA carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile</td>
			<td>Millipore (Merck)</td>
			<td>PFHYS1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Tape for 96-Well Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>295-3345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB58628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary cells / Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HMCPTS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopreserved Human Kupffer Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HUKCCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepDE19 cell line</td>
			<td>Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers/Probes/Standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV DNA forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV DNA reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GACAAACGGGCAACATACCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV DNA probe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3&#39;TAMRA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgRNA forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgRNA reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPS11 forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPS11 reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-HBV</td>
			<td>Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Lot 10102505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin Antibody, A80-129A</td>
			<td>Bethyl Laboratories. inc</td>
			<td>A80-129A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P</td>
			<td>Bethyl Laboratories. inc</td>
			<td>A80-229P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#&#160;A-11072</td>
			<td>Lot 1431810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip Vacuum pump</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-PN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip Pneumatic Hookup</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-PN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip platform</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-PN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip plate washing dock</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable metal forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SKU: SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow</td>
			<td>MGE worldwide</td>
			<td colspan="2">&#160;SAM12/01010101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NUAIRE 5800 SERIES incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-5841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated precision torgue</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual torque</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip compressor</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1</td>
			<td>Luminex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Millipore&#8482; 40-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoStar Optima Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLVER Precision electric screwdrivers</td>
			<td>VTECH ltd</td>
			<td>FAB10RE/FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLVER Power supply</td>
			<td>VTECH ltd</td>
			<td>EDU1FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAMBI VTS75D</td>
			<td>Air Equipment</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra Vacuboy</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

"liver-on-a-chip" cultures of primary hepatocytes and kupffer cells for hepatitis b virus infection

Trods den ekstraordinære smitteevne af hepatitis B virus (HBV) in vivo, hvor kun tre viral genomer kan resultere i en chronicity af eksperimentelt inficerede chimpanser, kræver mest in vitro-modeller flere hundreder til tusinder af viral genomer pr. celle i for at indlede en forbigående infektion. Derudover tillader statisk 2D kulturer af primære humane hepatocytter (PHH) kun kortsigtede undersøgelser på grund af deres hurtige dedifferentiation. Her beskriver vi 3D leveren-on-a-chip kulturer af PHH, enten i monokulturer eller i cocultures med andre nonparenchymal lever-resident celler. Disse tilbyder en betydelig forbedring af at studere langsigtede HBV infektioner med fysiologiske vært celle svar. Ud over at lette stof effekt undersøgelser, toksikologiske analyser og undersøgelser af patogenese, muliggøre disse mikrofluid kultur systemer evaluering af helbredende behandlinger for HBV infektion med henblik på at eliminere kovalent lukket, cirkulær (ccc) DNA. Dette præsenteret metode beskriver opsætning af PHH monokulturer og PHH/Kupffer Co cellekulturer, deres infektion med renset HBV og analyse af vært svar. Denne metode gælder især for vurdering af langtidsvirkningerne af HBV infektion, behandling kombinationer og patogenese.

Vi beskriver en simpel og alsidig platform til langtidskulturer primære menneskelige Kupffer celler og/eller hepatocytter og deres infektion med HBV. Primære menneskeceller udsås på kollagen-belagt polystyren stilladser inden for en mikrofluid plade samling, som løbende perfuses celler med vækstmediet (figur 1a).
PHH, som normalt kun er stabil i en begrænset periode i konventionelle kultur systemer, kan funktionelt opretholdes i længere perioder. Humant albumin, som udskilles af funktionelle hepatocytter og betragtes som den bedste markør for evalueringen af hepatisk metabolisme, er stabilt og højt udtrykt ved 3D kulturer indtil dag 40 efter såning (figur 2). For cocultures, kan Kupffer celle funktionalitet og levedygtighed vurderes af udskillelsen af specifikke cytokiner (fx IL6 og TNFα). For at måle cytokin produktion, anbefales brug af capture-baseret detektion midler på LPS-stimulation af cocultures (figur 3).
Celler danner hepatisk microtissues, normalt senest 3 dage efter såning af PHH, demonstrere funktionelle galde canaliculi og komplet celle polarisering (figur 2). Ud over at bevare deres fysiologiske cellulære metabolisme, blive disse kulturer usædvanligt modtagelige for HBV infektion. HBV DNA og andre virale markører, i modsætning til andre systemer, kultur, bliver let påviselige fra dag 2 efter infektionen (figur 4). Ud over udskilles markører af viral infektion, hepatocyt-holdige stilladser kan hentes fra kulturer og bruges til immunofluorescens påvisning af virusantigen (f.eks. HBsAg, HBcAg) (figur 4). Hvor konventionelle hepatocyt kulturer kræver podning med mindst 500 HBV GE pr. celle og tilsætning af 2% DMSO og 4% PIND, så lidt som 0.05 HBV GE er købedygtig indlede infektion i 3D-kulturer uden kravet i DMSO eller PIND (figur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> Figur 1: Opsætning af 3D-leveren-on-a-chip kulturer. (en) Dette er en skematisk layout til samling af kultur plade for at sikre oprettelsen af mikrofluid omsætning. (b) dette panel viser et nærbillede af kultur brønde, herunder filtrerpapir, stillads og låseringen. (c) dette panel viser processen med plade ækvilibrering før såning kulturer. De næste to paneler viser processen med såning for (d) hepatocyt monokulturer og (e) hepatocyt/Kupffer celle cocultures. (f) dette panel viser vask trin involveret i medium ændringer. (g) dette panel viser HBV infektion set-up, herunder fjernelse af inokulum. S.M. = seeding medium, M.M. = vedligeholdelse medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> Figur 2: hepatisk microtissue dannelse og hepatocyt levedygtighed. (en) dette panel viser langsgående brightfield billeder af 3D hepatocyt monokulturer demonstrerer microtissue dannelse efter såning. (b) dette panel viser immunofluorescens billeddannelse af kulturer for kerner (blå) og humant albumin (grøn). (c) dette panel viser langsgående samlede albumin, samt pr. celle justeret albumin produktion, under 40 dage for hepatocyt monokulturer, som bestemmes af ELISA. De viste data er gennemsnit ± SD. Dette tal er tilpasset fra Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> Figur 3: Kupffer celle funktionalitet i 3D-cocultures. Disse paneler viser sekretion af (en) IL6 og (b) TNFα i hepatocyt monokulturer og hepatocyt/Kupffer celler cocultures 11 dage efter såning i svar til eksogent tilføjet LP'ER på dag 9 post såning, som bestemmes ved hjælp af menneskelige magnetisk Luminex assay. Dette tal er tilpasset fra Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> Figur 4: HBV infektion i leveren-on-a-chip kulturer. (en) dette panel viser immunofluorescens mikroskopi påvisning af HBcAg (rød), HBsAg (grøn) og kerner (blå) 10 dage efter infektion i kulturer med HBV. (b) dette panel viser modtagelighed kulturer for HBV-infektion ved hjælp af forskellige multiplicities af infektion, som bestemmes af en kvantificering af HBV DNA i kultur analysere. (c) dette panel viser en kvantificering af de langsgående ophobning af HBV pgRNA i forhold til husholdning gen RPS11. De viste data er gennemsnit ± SD. Dette tal er tilpasset fra Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about "Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection at JoVE.com

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Lever-on-a-Chip" kulturer af primære hepatocytter og Kupffer celler for Hepatitis B virusinfektion

Målet med denne protokol er at give en trin for trin guide til at udføre 3-D "leveren-on-a-chip" infektion eksperimenter med hepatitis B-virus.

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål i hepatotropiske infektioner og leversygdom felter. Såsom bidrag af lever hjemmehørende cellepopulationer, til viral patogenese, langsgående infektion kinetik, mekanismer viral replikation, immun invasion, i en fysiologisk model system og drug test undersøgelser. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at opsummere en levermikromiljø.Som kan opretholdes i længere tid og er naturligt modtagelige for hepatitis B-infektion på fysiologiske relevante niveauer. Dette har tidligere været en grundlæggende begrænsning på hepatitis B-området. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod behandling eller diagnose af HBV-infektion, fordi test af lægemidler kan udføres i en fysiologisk platform for længere varigheder.Dette gør det muligt at evaluere sekventielle lægemiddelbehandlinger sammen med at analysere effekten af eksisterende og nye behandlingsstrategier. Denne metode kan give forståelse i hepatitis B, og kan også anvendes til andre undersøgelser af sygdom, herunder andre hepatotropiske infektioner, leversygdomme, eller lægemiddelmetabolisme undersøgelser. Generelt, personer nye til denne metode vil kæmpe, fordi det kræver opmærksomhed på særlige detaljer for at tillade en vellykket vedligeholdelse af levervæv i lange perioder.Og også fortrolig med de specialiserede værktøjer og udstyr. Visuel demonstration af denne metode er afgørende. Herunder samling af pladerne, samt optøning og såning af cellerne.Da skridt involveret i den langsigtede kultur af lever-afledte celler er udfordrende, når du bruger en ny kultur system. Tænd først både kompressoren og vakuumpumpen i forbindelse med leverchipplatformen. Fortsæt til et glasrørskab for at samle og ligevægte pladerne.Anbevis en steril membran på pladebunden for at begynde aseptisk at samle mikrofluidiske plader. Sørg for, at den sterile membran hviler jævnt på bundpladens to ben. Tilsæt derefter den godt indeholdende topplade.Tilsæt et sterilt pladelåg. Og brug et automatiseret præcisionsmoment, sat til 33 pund. Brug en spiral stramning sekvens til at stramme skruerne i bunden af pladen.Ved hjælp af et manuelt drejningsmoment skal du sørge for, at alle skruer er strammet til 35 pund. Dernæst pre-varme hepatocyte såning medium til 37 grader Celsius før priming. Anstæn skal den helt monterede plade sættes i vaskedokken.Og sørg for, at pladen klikker helt ind. Tilsæt 400 mikroliter hepatocyt såning medium til reservoiret side af hver brønd til prime pladen. Derefter påbegyndes strømmen i opadgående retning i 3,5 minutter ved en mikroliter pr. sekund.De røde indikatorer på siden af pladen vil indikere, om mikrofluidic cirkulationen fungerer korrekt. Når mediet er pumpet til cellevækst side af pladen, tilsæt en ekstra 1,2 milliliter hepatocyte såning medium. Overfør forsigtigt pladen ind i dockingstationen i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2.Start strømmen i opadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i 16 timer. Derefter overføres pladen til en vaskedok. Pipetter forsigtigt op og ned for at fjerne eventuelle bobler.Ved hjælp af en steril kraftafst, tilføje en steril rund filter papir til hver brønd. Derefter tilføje en celle vedhæftet fil stillads og en fastholde ring til hver brønd. Brug et sterilt stempel til at skubbe hver brønd ned og låse fastholdelsesringene og stilladserne på plads.Dernæst aspirere hele mediet. Og tilsæt forsigtigt 400 mikroliter af forvarmte hepatocyte såning medium over stilladset. Start strømmen i en nedadgående retning med en mikroliter pr. sekund i 3 1/2 minut.Aspirere alle medium pumpes ud af reservoiret side af pladen. Der tilsættes 1,4 milliliter hepatocytsåningsmedium til hver brønd. Derefter returneres pladen til dokken for at bringe det samlede volumen pr. brønd op til 1,6 milliliter.Først pre-varme hepatocyte optøning medium og hepatocyte såning medium til 37 grader Celsius. Dernæst tø et hætteglas af primære menneskelige hepatocytter i henhold til leverandørens anvisninger. I et glas rør kabinet, resuspend cellerne i en milliliter hepatocyte såning medium.Læg derefter de opsbrugte celler på is. Brug trypanblå, tælle cellerne for at sikre, at levedygtigheden af cellerne er over 90%Overfør den fuldt samlede plade til vaskedokken. Og aspirere alle medier fra brøndene.Hent cellerne fra isen, og tilsæt 600.000 hepatocytter til hver brønd i en 500-mikroliter volumen af hepatocyt såning medium. Start strømmen i nedadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund. Tilsæt 900 mikroliter hepatocyt såning medium til hver brønd for at bringe det samlede volumen i hver til 1,6 milliliter.Overfør pladen til dockingstationen i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og med 5% CO2. Start strømmen i nedadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i otte timer. Derefter skal strømmen vendes til den opadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i otte timer.Overfør derefter pladen til vaskedokken, og aspirere alle medier fra brøndene. Tilføj 400 mikroliter af hepatocyte vedligeholdelse medium til hver brønd. Og start flow i nedadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter per sekund i 3 1/2 minut.Dernæst aspirere alle medium fra reservoiret, og tilsæt 1,4 milliliter hepatocyte vedligeholdelse medium. Overfør pladen ind i dockingstationen i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Start strømmen i opadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i 48 timer.Efter 48 timer vaskes pladen ved at overføre den til vaskedokken. Aspirere alle medier fra brøndene. Og tilsæt 400 mikroliter af vedligeholdelsesmediet.Og indlede flow i den nedadgående retning på en mikroliter per sekund i 3,5 minutter. Derefter aspirere alle medium vises i reservoiret side af brøndene. Der tilsættes 1,4 milliliter hepatocyt vedligeholdelsesmedium.Overfør derefter pladen tilbage til dockingstationen i den befugtede inkubator. Start strømmen i opadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i 48 timer. Udskift mediet ved hjælp af denne vask-og-erstatte proces hver 48 timer.Primære menneskelige hepatocytter er normalt kun stabile i en begrænset mængde tid, når du bruger konventionelle kultursystemer. Men ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, kan de vedligeholdes funktionelt i længere tidsperioder. Human albumin udskilles af funktionelle hepatocytter, og anses for at være den bedste markør for evaluering af leverfunktionalitet.Albumin ses at være stabilt og højt udtrykt af 3D-kulturer indtil mindst dag 40 post-seeding. For co-kulturer evalueres Kupffer-cellernes funktionalitet og levedygtighed ved at måle udskillelsen af specifikke cytokiner. Som det ses her, de målte niveauer af IL-6 og TNF alpha viser, at cellerne var funktionelt vedligeholdt og levedygtige.Ud over at bevare deres fysiologiske cellulære stofskifte, disse kulturer blev usædvanligt modtagelige for HBV-infektion. HBV DNA og andre virale markører kan let påvises fra dag to efter infektion. Mens konventionelle kulturer kræver vaccination med mindst 500 HBV genomækvivalenter suppleret med DMSO og PEG, er disse 3D-kulturer inficeret med så lidt som 05 uforsynede genomækvivalenter.Ud over udskilles markører for virusinfektion, hepatocyte-holdige stilladser er hentet fra disse kulturer. Immunfluorescensmikroskopi afslører, at disse stilladser indeholder virale antigener. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at være blid, når håndtering af hepatocytter før såning for at undgå celledød.Derudover er det vigtigt at sikre, at pladerne er korrekt samlet, og alle flowkanaler tillader korrekt mediecirkulation før såning hepatocytterne. Efter denne procedure, andre metoder som immunofluorescens kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål. Herunder placeringen og hyppigheden af inficerede celler i vævet.Den fysiologiske tilstand af hepatocytter kan også vurderes ved farvning for albumin eller leverstrukturer, herunder stramt kryds protein ZO-1. Efter denne udvikling, denne teknik baner vejen for forskere inden for virologi at udforske hepatitis B-infektion og immunrespons i en fysiologisk 3D-model system. Glem ikke, at arbejde med hepatitis B-virus kan være farligt, og forholdsregler såsom tidligere vaccination, brug af passende PPE, og arbejder under passende retningslinjer for biosikkerhed bør altid tages, mens du udfører denne procedure.