Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller

I deres fysiologiske miljø udsættes pattedyrceller ofte for mekaniske og biokemiske understreger, at resultere i plasma membran skader. Svar på disse skader reseal komplekse molekylære machineries hurtigt plasma membran for at genoprette sin barriere funktion og vedligeholde celle overlevelse. Trods 60 års forskning på dette område mangler vi stadig en grundig forståelse af cellen genforsegling maskiner. Med mål at identificere cellulære komponenter at kontrol plasmamembran genforsegling eller lægemidler, der kan forbedre lukning, har vi udviklet et fluorescens-baserede høj overførselshastighed assay, der måler plasmamembran genforsegling effektivitet i pattedyrceller kulturperler i mikroplader. Som en modelsystem for plasma membran skader, celler er udsat for bakteriel poreformede toksin listeriolysin O (LLO), der danner store 30-50 nm diameter proteinholdige porer i kolesterol-holdige membraner. Brug af en temperatur-kontrolleret multi-mode mikrotiterplade læser giver mulighed for hurtige og følsomme spectrofluorometric målinger i kombination med brightfield og Fluorescens mikroskopi billeddannelse af levende celler. Kinetic analyse af fluorescens-intensiteten udsendes af en membran impermeant nukleinsyre-bindende fluorokrom afspejler omfanget af membran sårede og lukning på befolkningsniveau celle, giver mulighed for beregning af cellen genforsegling effektivitet . Fluorescens mikroskopi imaging giver mulighed for tælling af celler, som constitutively udtrykker en fluorescerende chimera af nukleare protein Histon 2B, i hver brønd af mikrotiterplade for at tage højde for potentielle ændringer i deres antal og giver mulighed for eventuel identifikation af forskellige cellepopulationer. Denne høj overførselshastighed assay er et kraftfuldt værktøj forventes at udvide vores forståelse af membran reparation mekanismer via screening for værten gener eller eksogent tilføjet forbindelser at kontrol plasmamembran lukning.