南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

オフターゲット効果の問題やゲノムの編集、萌芽期の茎のデザイナーの核酸分解酵素のアプリケーションで長い DNA 断片を挿入することの難しさに相対パス (ES) 細胞を用いた遺伝子ターゲティング技術これらの欠点を持たないし、広く動物/マウスのゲノムに至る大規模な削除/挿入単一のヌクレオチドの置換を変更するために使用。特に、比較的少数の相同組換え (HR) イベントを取得する必要を識別する希望 ES クローンです重要なステップ、正確かつ信頼性の高い方法を要求します。南しみが付くことおよび/または従来の PCR がしばしばこの目的に用いられます。ここでは、内因性 Myh9 遺伝子が中断しその他非ミオシン重鎖 IIs (NMHC IIs) をコードする Cdna を置き換え、マウス ES 細胞に発生した HR イベントを識別するためにこれらの 2 つの方法を使用しての詳細な手順について述べる。南しみが付くことの全体の手順は、vector(s)、エレクトロポレーション、医薬品の選択、拡大および ES 細胞/クローン、準備、消化のストレージをターゲットとゲノム DNA (gDNA) 交配のしみが付くことの建設を含む、渦、および x 線フィルムの放射線写真法の最後のステップの洗浄。PCR は、準備および希薄化後 gDNA を直接実行できます。理想的な結果を得るためには、プローブと制限酵素 (再) 南にしみが付くことのための切断サイトと PCR のためのプライマーを慎重に計画した必要があります。南しみが付くことおよび PCR による迅速スクリーニングによって正確に識別が説明されているこれらの方法の単独または複合アプリケーションを許可する南にしみが付くことの実行は時間のかかり、労働集約的な PCR の結果が偽陽性を持つも、本稿で広く使用され、ES 細胞の遺伝子は遺伝子型同定のほとんどの演習で相談する動物を変更しました。