마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

오프 대상 효과의 문제 및 디자이너 nucleases 게놈 편집, 배아 줄기에 대 한 응용 프로그램에서 긴 DNA 파편을 삽입의 어려움에 상대 (ES) 세포 기반 유전자를 대상으로 이러한 결점 없는 기술과 널리 큰 삭제/삽입에서 단일 염기 치환에 이르기까지 동물/마우스 게놈을 수정 하는 데 사용. 특히, 상대적으로 적은 동종 재결합 (HR) 이벤트를 얻기 위해 필요한 식별 원하는 ES 클론은 정확 하 고 안정적인 방법 요구 중요 한 단계. 남부 럽 또는 기존의 PCR 수시로이 목적을 위해 활용 됩니다. 여기, 우리는 그 두 가지 방법을 사용 하 여 마우스 ES 세포는 생 Myh9 유전자는 중단 하 고 다른 nonmuscle myosin 무 겁 사슬 IIs (NMHC IIs) 인코딩 cDNAs에 의해 대체 하기 위한 것에서 발생 하는 시간 이벤트를 식별 하는 자세한 절차를 설명 합니다. 남부 럽의 모든 절차는 vector(s), electroporation, 약물 선택, 확장 및 ES 세포/클론, 준비, 소화, 저장을 지정 하 고 게놈 DNA (gDNA)는 교 잡의 럽의 건설을 포함 하 고 probe(s), 및 x-선 필름에 autoradiography에의 마지막 단계 세척. PCR는 준비 하 고 희석 gDNA를 직접 수행할 수 있습니다. 이상적인 결과 얻기 위해 프로브 및 (재) 남부 럽에 대 한 절단 사이트 및 PCR 위한 뇌관 제한 효소 수 신중 하 게 계획 합니다. 비록 남부 럽의 실행 시간과 노동 집약적 이며 PCR 결과 판정, 남부 럽 및 PCR에 의해 신속한 검사 하 여 올바른 식별 설명 하는 이러한 방법을 단독 또는 결합 된 응용 프로그램 허용 널리 사용 하 고 대부분의 실험실 genotypes ES 세포 및 유전자의 식별에 의해 상담이 종이에서 동물 수정.