Forfatterne vil gerne takke Animal Services-teamet på Pirbright Institut for deres ekspertise i udklækning, opdræt og nedslagtning fugle og ekspertise af Caroline Holt i aseptisk fjernelse bursa af Fabricius. A.B. er finansieret gennem bioteknologien og Biological Sciences Research Council (BBSRC) via give BBS/E/jeg/00001845, K.D. er finansieret gennem BBSRC via studentship BBS/E/jeg/00002115 og A.A. er finansieret gennem det nationale center for den Erstatning, forfining & reduktion af dyr i forskning (NC3Rs) via give NC/R001138/1.

Alle procedurer med dyr skal etisk godkendt på forhånd. I vores institution udføres alle procedurer i overensstemmelse med britiske dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 under Home Office oprettelse, personlig og projekt licenser, efter godkendelse af den interne dyrevelfærd og etiske Review Board (AWERB).
1. forberedelse af chCD40L
<ol><li>Kultur HEK 293-msCD8-CD40L celler, der stabilt udtrykker et opløseligt chCD40L konstruere i 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium suppleret med 10% varme-inaktiverede (Hej) føtalt kalveserum (FCS) og 1 µg/mL puromycin ved 37 ° C i en atmosfære, der indeholder 5% CO 2. Bemærk: Disse celler er tilgængelige fra Pirbright Institut efter undertegnelsen af den passende materielle overførsel aftale.</li>
	<li>Opdel celler på en 1:5 tæthed når sammenflydende. Indsamle supernatanten (der indeholder opløselige chCD40L konstruktion) hver gang cellerne er opdelt, centrifugeres det ved 400 x g for 5 min at fjerne celleaffald, og opbevar den ved 4 ° C.</li>
	<li>Når 500 mL af supernatanten er blevet indsamlet, pool væske og filter-sterilisere det gennem en 0,2 µm filter.</li>
	<li>Koncentrere supernatanten ved hjælp af centrifugal protein koncentratorer med en molekylvægt cutoff 10 k efter fabrikantens anvisninger. Ekstrakt koncentreret supernatanten fra hver kolonne og samle det filter-sterilisere det ved, at det gennem et 0,22 µm sprøjte filter.</li>
	<li>Bestemme den endelige koncentration skal anvendes i eksperimenter ved seriel fortynding af chCD40L opløsning i 1 x Iscove's modificerede Dulbecco's medium (IMDM) (beskrevet i trin 2.4) og dyrkningsbaserede primære bursal celler i overværelse af Fortyndingerne. Bestemme antallet og procentdelen levedygtigheden af celler dagligt i op til en uge. Bemærk: Den laveste koncentration, hvor celleproliferation og levedygtighed er tilstrækkelig er koncentrationen til brug i analysen. Dette er sandsynligvis vil være mellem 1:20 og 1:50.</li>
</ol>2. forberedelse af løsninger til kylling primære Bursal celle Isolation
<ol><li>Forberede 1 x Hanks' afbalanceret saltopløsning (HBBS) med calcium (Ca) ved tilsætning af 10 mL af 10 x HBBS med Ca 90 ml sterilt H2O og 0,47 µL af 7,5% NaHCO3.</li>
	<li>Forberede collagenase D stamopløsning på 8 mg/mL i 1 x HBBS med Ca. Filter-sterilisere løsningen gennem en 0,2 µM filter. Bemærk: Det anbefales at forberede 5 mL alikvoter og fryse dem ved-20 ° C.</li>
	<li>Forberede 1 x RPMI medium suppleret med 5% Hej FCS. Gemme medier ved 4 ° C.</li>
	<li>Forberede 1 x 500 mL af IMDM suppleret med 8% Hej FCS, 2% Hej kylling serum, 50 mM β-mercaptoethanol, 50 µL af insulin-transferrin-natrium-selenite, og 1% penicillin/streptomycin. Gemme medier ved 4 ° C. Bemærk: Forberede alle de ovennævnte løsninger på forhånd.</li>
	<li>Forberede 1 x HBBS med Ca. Store løsning på is.</li>
	<li>Forberede 1 x HBBS uden Ca ved tilsætning af 10 mL af 10 x HBBS uden Ca 90 ml sterilt H2O, 0.47 µL af 7,5% NaHCO3og EDTA i en endelig koncentration på 10 mM. Gemme løsningen på is.</li>
	<li>Forberede 1 x collagenase D løsning ved at tilføje 5 mL af stamopløsningen collagenase D 13 mL af HBBS med Ca til at gøre alt på 18 mL. Gemme løsningen på is. Bemærk: Forberede de løsninger, der er nævnt i trin 2,5-2,7 på dagen af forsøget.</li>
</ol>3. fjernelse af Bursa af Fabricius (BF)
<ol><li>Bageste og klækkes kyllinger i en passende, godkendte facilitet og humant udsætterkøer dem 2-3 uger gamle. Bemærk: Brug institute-godkendte metoder til aflivning.</li>
	<li>
Indsamle BF fra hver kylling med aseptisk teknik. Bemærk: Brug protokollerne på plads på institutionen.<ol>
<li>Placer slagtekroppen i dorsal recumbency og sterilisere hud og fjer overliggende maven og brystkassen med en opløsning af 70% ethanol, fortyndet i vand.</li>
		<li>Gøre en ventrale midterlinjen snit i underlivet ved hjælp af en steriliseret skalpel eller en saks.</li>
		<li>Find bursa af Fabricius, der er tilsluttet den caudale del af tyktarmen, kranie til kloak.</li>
		<li>Ved hjælp af saks, klippe bursa af Fabricius gratis fra tyktarmen og steriliseret pincet. Sørge for at undgå punktering tarmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer orglet i kolde PBS og overføre det til laboratoriet på is. Bemærk: primærelementer skal være isoleret hurtigst muligt efter høståret orgel.</li>
</ol>4. isolering af kylling primære Bursal celler
<ol><li>Arbejder i en mikrobiologisk sikkerhed kabinet, vaske BF mindst 3 x i 30 mL PBS, koldt.</li>
	<li>Overføre væv til en petriskål (92 mm i diameter, 21 mm i højden) og tilsættes 5 mL af 1 x collagenase D løsning.</li>
	<li>Ved hjælp af steril saks eller en skalpel kniv, skæres BF i stykker paa mindre end 5 mm i diameter.</li>
	<li>Inkuber væv ved 37 ° C med periodiske blid agitation i 30 min. Bemærk: Collagenase løsning vil begynde at fordøje væv.</li>
	<li>Med en steril pipette overføres Pasteur, gentagne gange Aspirér blandingen for at fremme opløsningen af væv. Om nødvendigt skære væv i mindre stykker.</li>
	<li>Tilføje en anden 5 mL af 1 x collagenase D løsning til væv og der inkuberes ved 37 ° C med periodiske blid agitation for en anden 30 min.</li>
	<li>Gentag trin 4.6 og 4.7 indtil væv er fuldstændig fordøjet. Bemærk: Der vil være små granuler, der ikke opløses yderligere.</li>
	<li>Passere cellesuspension gennem en 100 µm celle si i 20 mL af 1 x HBBS uden Ca.</li>
	<li>Der centrifugeres cellesuspension ved 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Supernatanten og resuspenderes i 10 mL af 1 x RPMI med 5% FCS.</li>
	<li>Enten overlay 10 mL cellesuspension oven på 5 mL af tæthed gradient medier indeholdende polysucrose og natrium diatrizoate eller underlag 5 mL af tæthed gradient medier under 10 mL cellesuspension. Sikre, at der er en klar grænseflade mellem to.</li>
	<li>Centrifugeres overlay på 900 x g i 20 min. ved 4 ° C. Sænke eller fjerne centrifuge pause. Bemærk: Cellerne skal danne et band på grænsefladen mellem celle medier og tæthed gradient medier.</li>
	<li>Med en steril pipette overføres Pasteur, fjerne cellerne og placere dem i kolde PBS. Vaske cellerne 3 x ved centrifugering dem ved 400 x g i 5 min og resuspending dem i kolde PBS.</li>
</ol>5. kultur af kylling primære Bursal celler
<ol><li>Centrifugeres cellesuspension ved 400 x g i 5 min og resuspend dem i 1 x komplet IMDM.</li>
	<li>Tage en alikvot af cellesuspension, føje det til en Trypan blå løsning og tælle antallet af levedygtige celler, der udelukker Trypan blå. Bestemme antallet af celler og procentdel levedygtighed.</li>
	<li>Centrifugeres cellesuspension ved 400 x g i 5 min og resuspend det i komplet IMDM suppleret med en 1:20 fortynding af kylling CD40L med en tæthed på 1 x 107 celler/mL. Titreres koncentreret supernatanten indeholdende chCD40L for at bestemme den optimale fortynding, som forventes at ligge i intervallet i 1:10 til 1:50.</li>
	<li>Kultur celler i enten 96 - eller 24-godt plader ved 37 ° C for 48-72 h. rundbundede 96-brønd plader er at foretrække frem for fladbundede plader. Bemærk: Celler kan også være kulturperler ved 40 ° C</li>
</ol>6. infektion af kylling primære Bursal celler med IBDV
<ol><li>48-72 h efter isolation, tø en alikvot af virus, vortex prøven, og gemme det på is.</li>
	<li>Resuspend de primære bursal celler, tage en 10 µL alikvot af cellesuspension, tilføjes 10 µL af Trypan blå opløsning og bestemme antallet af celler og procentdel levedygtighed.</li>
	<li>Fortyndet virus i 1 x komplet IMDM til den passende mangfoldighed af infektion (MOI) at gøre virus inokulum og vortex.</li>
	<li>Der centrifugeres cellesuspension ved 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Fjern supernatanten og resuspend celler i virus inokulum.</li>
	<li>Inkuber cellesuspension ved 37 ° C i 1 time med periodiske agitation.</li>
	<li>Centrifugeres cellesuspension ved 400 x g i 5 min, fjerne virus inokulum og vaske cellerne i 1 x komplet IMDM medier.</li>
	<li>Centrifugeres cellesuspension ved 400 x g i 5 min og Fjern supernatanten resuspend celler i komplet IMDM media suppleret med kylling CD40L med en tæthed på 1 x 107 celler pr. mL.</li>
	<li>Kultur, cellerne i enten 96 - eller 24-godt plader ved 37 ° C. Bemærk: Celler kan også være kulturperler ved 40 ° C</li>
</ol>7. kvantificering af IBDV replikering i kylling primære Bursal celler
<ol><li>På det ønskede tidspunkt efter infektion, resuspend cellerne, overføre dem til en passende tube, centrifugeres dem ved 400 x g i 5 min og høste supernatanten for virus titrering af enten plaque assay eller TCID50 assay som Reed-Muench metode15.</li>
	<li>Vaske cellerne i 1 mL PBS og forberede dem enten for immunfarvning med et antistof, der er specifikke for IBDV, eller udtrække RNA ved hjælp af en passende kit (efter producentens anvisninger) og udføre reverse transkription kvantitative polymerase kæde reaktion (RT-qPCR) ved hjælp af primere specifikke for et IBDV-gen (fremad, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Omvendt, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Mock-inficerede cellekulturer bør anvendes som en kontrol.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoerr, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+aspects+of+immunosuppression+in+poultry.">Clinical aspects of immunosuppression in poultry.</a> Avian Diseases. 54 (1), 2-15 (2010).</li><li>Schermuly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+lytic+replication,+latency,+and+transformation+of+an+oncogenic+alphaherpesvirus.">In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).</li><li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursal+immunopathology+responses+of+specific-pathogen-free+chickens+and+red+jungle+fowl+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. , (2018).</li><li>Farhanah, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursal+transcriptome+profiling+of+different+inbred+chicken+lines+reveals+key+differentially+expressed+genes+at+3+days+post-infection+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+Toll-like+receptor+pathway+and+related+genes+of+chicken+bursa+after+experimental+infection+with+infectious+bursa+disease+virus.">Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus.</a> Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Regulation+of+chTLR3+by+Infectious+Bursal+Disease+Viruses+with+Different+Virulence.">Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence.</a> In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).</li><li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+profiles+of+the+responses+of+chicken+bursae+of+Fabricius+to+IBDV+in+different+timing+phases.">Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases.</a> Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).</li><li>Rasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+immune+response+and+cytokine+profiles+in+the+bursae+and+spleen+of+chickens+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).</li><li>Ruby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+reveals+a+possible+role+for+the+timing+of+the+inflammatory+response+in+determining+susceptibility+to+a+viral+infection.">Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection.</a> Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).</li><li>Smith, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+early+immune+response+to+infection+by+infectious+bursal+disease+virus+in+chickens+differing+in+their+resistance+to+the+disease.">Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease.</a> Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).</li><li>Tregaskes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+biological+properties+of+the+CD40+ligand,+CD154+in+a+non-mammalian+vertebrate.">Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).</li><li>Kothlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand+supports+the+long-term+maintenance+and+differentiation+of+chicken+B+cells+in+culture.">CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).</li><li>Dulwich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+chicken+primary+B+cells+infected+ex+vivo+with+attenuated+and+very+virulent+strains+of+infectious+bursal+disease+virus+(IBDV).">Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV).</a> Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).</li><li>Soubies, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+infectious+bursal+disease+virus,+including+non-cell-culture-adapted+strains,+using+ex+vivo-stimulated+chicken+bursal+cells.">Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells.</a> Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).</li><li>Reed, L., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).</li><li>Hui, R. K., Leung, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Expression+Profile+of+Chicken+Embryo+Fibroblast+DF-1+Cells+Infected+with+Cell-Adapted+Infectious+Bursal+Disease+Virus.">Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus.</a> PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).</li><li>Li, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+of+chicken+embryo+cell+cultures+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus.</a> Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+chicken+dendritic+cell+response+to+infectious+bursal+disease.">Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease.</a> BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).</li><li>Quan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiles+in+bursal+B-lymphoid+DT40+cells+infected+with+very+virulent+infectious+bursal+disease+virus.">Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus.</a> Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).</li><li>Wong, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+differentially+expressed+transcripts+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptotic+chicken+embryonic+fibroblasts+by+using+cDNA+microarrays.">Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays.</a> Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

I denne undersøgelse, vi beskrive den succesfulde kultur af kylling primære bursal celler ex vivo i overværelse af opløselige chCD40L og vise, at disse celler kan støtte replikering af en svækket stamme og en meget ondartet stamme af IBDV. Denne ex vivo model kan bruges til at bestemme, hvordan cellerne reagerer på en IBDV infektion13, som har klare fordele over i vivo og in vitro- undersøgelser.
Når høst af BF, er det afgørende at ikke punktere tarmen for at undgå bakteriel forurening af de isolerede bursal celler. Derudover er det vigtigt at isolere primærelementer hurtigst muligt efter høståret orgel at begrænse celledød. Behovet for at bruge chCD40L er en begrænsning af teknikken; arbejde udført af Soubies et al. viser imidlertid, at anvendelsen af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) at forlænge bursal cellernes levedygtighed i stedet for chCD40L14 kan aktivere model skal vedtages af et større antal laboratorier. Den protokol, der er skitseret ovenfor bestemmer den optimale koncentration af chCD40L empirisk, ved dyrkning af primære B celler i seriefremstillede fortyndet koncentrationen af molekylet og observere celleproliferation og levedygtighed. En potentiel ændring til protokollen kunne være at rense chCD40L molekyle og tilføje en bestemt koncentration til celle kultur medier til at undgå batch til batch variationer.
In vivo studier har vist at følgende IBDV infektion, der er en stigning i udtrykket af gener involveret i pro-inflammatoriske cytokine svar, Type I IFN svar og apoptose i BF5,9,10 . Men efter infektion, der er en tilstrømning af inflammatoriske celler og effektor T celler i BF, som adskiller sig i de gener de udtrykker i forhold til inficerede B-celle population9. Det er derfor vanskeligt at fortolke hvordan inficerede celler reagerer på IBDV. For at løse dette, har nogle forskningsgrupper karakteriseret det transkriptionel svar af celler inficeret med IBDV i kultur16,17,18,19,20. Disse in vitro- undersøgelser har fordelen af veldefinerede MOIs og tid-point efter infektion. Men, in vitro- undersøgelser har typisk været præget enten fibroblast celler16,17,20 eller dendritiske celler18. Mens giver indblik i værtssammenspil celle-IBDV, den nuværende tro er at infektion af B-celler er afgørende for patogenesen af IBDV og derfor, relevansen af data kan ikke være overinterpreted. Før vores ex vivo bursal celle kultur model, havde kun én undersøgelse karakteriseret den cellulære reaktion af B-celler til IBDV infektion19; dog, denne undersøgelse udnyttet en udødeliggjort B cellelinje, som var forvandlet på grund af infektion med ALV, begrænser de konklusioner, der kunne gøres. Derimod modellens ex vivo af IBDV infektion beskrevet her gør det muligt for forskere at bevare fordelene ved in vitro- undersøgelser, som definerede MOIs og tid-point, mens de studerer vekselvirkninger mellem virus og dens relevante vært celle. Som de primære bursal celler er fremstillet af ikke-inficerede BF væv, der er ikke inflammatoriske eller T celler til stede, og vi har demonstreret af flow flowcytometri (ved hjælp af standardbetingelser), at følgende chCD40L stimulation, 97% af cellen befolkningen er positiv for B-celle markør Bu-1 (data ikke vist). 3% af cellerne er Bu-1 negative, det vil være interessant at afgøre, om disse celler blive smittet med IBDV og udforske deres genekspression og bidrag til patogenesen.
Vi forventer, at ex vivo kylling primære bursal celle kultur model kan også udvides til at studere celle-virus værtssammenspil af andre B-celle tropic virus inficerer kyllinger, som ALV eller REV, og kunne også udvides til andre fuglearter ( fx, ænder og kalkuner). Evnen til at kultur primære bursal celler ex vivo også åbner mulighed for at undersøge aspekter af patogenesen og immunosuppression forårsaget af disse vira uden at inficere fugle. Som i vivo undersøgelser forårsage betydelig sygelighed, vil dette have en betydelig indvirkning på udskiftning, raffinement og reduktion af brugen af dyr i forskning.
I Resumé, ex vivo kylling primære bursal celle kultur modellen beskrevet her har potentiale til at udvide forståelsen af hvordan aviær B-celle tropic virus interagere med deres værtsceller samtidig reducere antallet af fugle i in vivo infektion undersøgelser. Teknikkerne, der kan anvendes til flere lymfoide organer, flere vira og potentielt, flere arter af fugle, hvilket gør det til en attraktiv model, der kan bidrage til felterne af aviær virologi og Immunologi.

Den globale fjerkræindustrien er afgørende for at sikre nok mad til en voksende befolkning. Men immunosuppression er trussel mod fødevaresikkerheden og velfærd for berørte fugle og udgør en afgørende økonomiske udfordring for branchen. Fleste tilfælde af immunosuppression i kyllinger er forårsaget af infektion med immunsupprimerende virus, med de mest ansvarlige for forringer erhvervet immunitet har en tropisme for T- og B-lymfocytter1. I fugle er fleste af B-celler placeret inden for et organ, der er kendt som bursa af Fabricius (BF). B-celler er modtagelige for infektion med flere immunsupprimerende virus, herunder dem, der forårsager lysis, såsom IBDV og Marek's disease virus (MDV), og dem, der forårsager transformation, såsom aviær kvægleukose virus (ALV) og reticuloendotheliosis virus ( REV).
For at udvikle bedre strategier for at kontrollere disse infektioner, er det afgørende at karakterisere virus interaktion med kylling B celler. Men når B-celler er fjernet fra en fugl, de ikke overlever godt i ex vivo kultur2, hvilket gør det vanskeligt at foretage en grundig analyse af samspillet mellem IBDV med kylling B celler, eller de tidlige begivenheder efter ALV eller REV infektion. Derfor, mange værtssammenspil celle-virus har været studeret i vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Selv om disse undersøgelser er informative, indebærer de brug af inficerede fugle, der lider af sygdomme, der kan være alvorlige.
CD40 ligand er et molekyle, der inducerer B celle spredning11. Efter identifikation af genet kodning kylling CD40L (chCD40L), en opløselig fusion protein var manipuleret, når føjet til mediet, induceret spredning af kylling primære B celler ex vivo12. I 2015 fandtes B celler dyrkes på denne måde at støtte replikering af MDV2 og i 2017, vi og andre konstateret at primære bursal celler stimuleret med chCD40L kunne bruges som en model til at studere IBDV replikering13,14. Her beskriver vi isolation og kultur af kylling primære bursal celler, infektion af celler med IBDV og kvantificering af viral replikation. Selv om vi beskrive metoden i forbindelse med BF, kan dette anvendes til at isolere og kultur celler fra forskellige lymfoide organer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>heat-inactivate at 56&#176;C for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex-GP Syringe Filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F7648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14060-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl2 - MgCl2</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C5405-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol 50mM</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin-transferrin-sodium-selenite</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics GmbH</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1083</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10831-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo chicken primary bursal-cell culture model to study infectious bursal disease virus pathogenesis

Smitsomme bursal disease virus (IBDV) er en birnavirus af økonomisk betydning for fjerkræindustrien. Virussen inficerer B celler, der forårsager sygelighed, dødelighed og immunosuppression i inficerede fugle. I denne undersøgelse beskriver vi isolering af kylling primære bursal celler fra bursa af Fabricius, kultur og infektion i celler med IBDV og kvantificering af viral replikation. Tilsætning af kylling CD40 ligand markant øget celleproliferation firedoblet over seks dage af kultur og betydeligt forbedret cellernes levedygtighed. To stammer af IBDV, en cellekultur tilpasset stamme, D78 og en meget ondartet stamme, UK661, replikeres godt i cellekulturer ex vivo . Denne model vil være til nytte ved afgørelsen af, hvordan celler reagerer på IBDV infektion og vil tillade en reduktion i antallet af inficerede fugle bruges i IBDV patogenese undersøgelser. Modellen kan også udvides til at omfatte andre vira og kunne anvendes til forskellige arter af fugle.

Kylling primære Bursal celler kan være kulturperler i overværelse af kylling CD40L
Når kylling primære bursal celler blev kulturperler i overværelse af opløselige chCD40L, steg antallet af celler firedoblet fra 9.02 x 105 til 3.63 x 106 pr. mL over en periode på 6 dage, i modsætning til da det var fraværende (p < 0,05) ( Figur 1A). Cellernes levedygtighed var også væsentligt forbedret, for eksempel fra 25% på dag 3 efter kultur i mangel af chCD40L til 48% i overværelse af chCD40L (p < 0,05) (figur 1B)13.
Kylling primære Bursal celler kan støtte replikering af både cellekultur tilpasset og meget virulente stammer af IBDV
Mock-inficeret og inficerede cellekulturer rettet 18 h efter infektionen er sket, mærket med et monoklonalt antistof mod IBDV VP2 og en sekundær antistof konjugeret med Alexa Fluor 488, og counterstained med DAPI. Inficerede celler havde bevis af grønne fluorescens omkring kernen (figur 2A), forenelig med tilstedeværelsen af IBDV i cytoplasmaet. Det var tydeligt for to stammer af IBDV, en cellekultur tilpasset stamme, D78 og en meget ondartet stamme, UK661 (figur 2A). På 5, 18, 24 og 48 timer efter infektion, var RNA ekstraheret fra inficerede kulturer og underkastes RT-qPCR med primere en bevaret områdespecifikke af IBDV VP4 genet. Udtryk for VP4 blev først normaliseret til hus-holder gen TBP og derefter udtrykt fold ændring i forhold til mock prøver i en ΔΔCt analyse. IBDV VP4 udtryk steg til 16,603 eksemplarer på 48 timer efter infektion med D78 og 38,632 eksemplarer på 48 timer efter infektion med UK661. Taget sammen, viser disse data, at kylling primære bursal celler kunne støtte replikering af celle-kultur-tilpasset og meget virulent IBDV stammer13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig1.jpg"> Figur 1: kylling primære bursal celler kan være kulturperler i overværelse af kylling CD40L. Kylling primære bursal celler blev kulturperler i tilstedeværelse eller fravær af chCD40L (sort barer og hvide stænger, henholdsvis). (A) antallet af levende celler og (B) procentdelen af levedygtige celler blev bestemt på angivne tidspunkter efter infektion. De viste data er repræsentative for mindst tre Repliker eksperimenter, fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for middelværdien og den statistiske signifikans blev bestemt ved hjælp af parrede Student's t-test på hvert tidspunkt, * p < 0,05. denne figur er blevet ændret med tilladelse fra Dulwich et al. 13.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58489/58489fig2.jpg"> Figur 2: kylling primære bursal celler kan støtte replikering af både cellekultur, tilpasset og meget virulente stammer af IBDV. (A) kylling primære bursal celler var mock-smittet eller inficeret med enten D78 eller UK661 og en prøve fra hver kultur var fast, mærket og afbildet: IBDV VP2, grøn; kerner, blå. Skalalinjen = 7 µm. (B) RNA blev udtrukket på de angivne tidspunkter efter infektion, reverse-transskriberet, og en bevaret region af IBDV VP4 genet blev forstærket af kvantitativ PCR. Log10 fold ændre i VP4 eksemplarnummer var normaliseret TBP husholdning gen og udtrykt i forhold til mock-inficerede prøver pr. 2-ΔΔCT metode. De viste data er repræsentative for mindst tre Repliker eksperimenter, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for middelværdien. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Dulwich et al. 13.

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis at JoVE.com

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Her beskriver vi isolering af kylling primære bursal celler fra bursa af Fabricius, kultur og infektion i cellerne med smitsomme bursal disease virus og kvantificering af viral replikation.

En Ex Vivo kylling primære Bursal-cellekultur Model til at studere smitsomme Bursal Disease Virus patogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i aviær virologi området, såsom hvordan immunsuppressive vira interagerer med B-celler. Den største fordel ved denne teknik er, at celler er mere relevante end udødeliggjorte cellelinjer, der i øjeblikket anvendes i laboratoriet. Selvom denne metode giver indsigt i, hvordan kyllingceller reagerer på IBDV, kan den også anvendes på ALV og REV.Denne metode reducerer antallet af fugle i vores forskning, og det er til gavn for de tre R'er, som står for udskiftning, reduktion og raffinering af brugen af dyr i forskning. I et mikrobiologisk sikkerhedsskab vaskes BF'en i 30 milliliter kold PBS mindst tre gange. Overfør det vaskede væv til en petriskål, og tilsæt fem milliliter af en 1X collagenase D opløsning.Brug steril saks eller en skalpel klinge til at skære BF i stykker, der er mindre end fem millimeter i diameter. Inkubere ved 37 grader Celsius med periodisk blid omrøring i 30 minutter. Efter dette, bruge en steril Pasteur pipette til gentagne gange at aspirere blandingen for at fremme opløsning af vævet.Tilføj yderligere fem milliliter 1X collagenase D opløsning til vævet, og inkubere det ved 37 grader Celsius med periodisk blid omrøring i yderligere 30 minutter. Gentag denne proces, aspirere blandingen, tilføje frisk kollagen D opløsning, og inkubere indtil vævet er helt fordøjet. Bemærk, at der vil være små granulat, der ikke vil opløses yderligere.Den fordøjede cellesuspension overføres gennem en 100 mikroncellest si i 20 milliliter 1X HBBS uden calcium. Centrifuge ved 400 gange g i fem minutter. Kassér supernatanten, opsplit pellet i 10 milliliter 1X RPMI med 5% FBS.Derefter overlejre 10 milliliter af celle suspensionen på toppen af fem milliliter densitet gradient medier, der indeholder polysucrose og natriumdiatrizoat. Sørg for, at der er en klar grænseflade mellem de to lag. Centrifuge ved 900 gange g og fire grader Celsius i 20 minutter.Cellerne skal danne et bånd på grænsefladen mellem cellemediet og tætheden gradient medier. Brug derefter en steril Pasteur-pipette til at fjerne cellerne og overføre dem til et rør, der indeholder kold PBS. Cellerne vaskes ved centrifugering ved 400 gange g i fem minutter, hvor de igen opsprænes i kold PBS.Gentag denne vask tre gange. Først centrifuger celleaffjedringen ved 400 gange g i fem minutter. Opsalt cellerne i 30 milliliter 1X komplet IMDM.Tag en prøve af cellesuspensionen, og tilføj den til en tosseblå opløsning. Tæl antallet af levedygtige celler, der udelader Den blå Trypan, og bestem antallet af celler og den procentvise levedygtighed. Herefter centrifugeres celleaffyringen ved 400 gange g i fem minutter.Resuspend cellerne i komplet IMDM suppleret med en en-til-20 fortynding af kylling CD40 ligand på en tæthed på 10 millioner celler pr. milliliter. Cellerne kultureres i enten 96-eller 24-brøndsplader i 48 til 72 timer. 48 til 72 timer efter isolation, tø en aliquot af virus.Vortex prøven, og gemme den på is. Opsaltning af de primære bursalceller i IMDM-mediet. Tag en 10-mikroliter aliquot af celle suspension, og tilføje det til 10 mikroliter af en Trypan blå løsning.Derefter bestemme antallet af celler og procent levedygtighed. Fortyndet virus i 1X komplet IMDM til passende mangfoldighed af infektion for at gøre virus inokulum. Bland denne fortynding ved vortexing.Centrifuge celle suspension ved 400 gange g i fem minutter. Dernæst fjerne supernatant, og resuspend cellerne i virus inokulum. Inkubere ved 37 grader Celsius i en time med periodisk omrøring.Herefter centrifugeres celleaffyringen ved 400 gange g i fem minutter. Fjern virusinoculum, og vask cellerne i 1X komplet IMDM-medier. Kultur cellerne i enten 96-eller 24-brønd plader.I denne undersøgelse, kylling primære bursal celler er successivt dyrket ex vivo i overværelse af opløselige kylling CD40 ligand. Celler dyrket i nærvær af opløselige kylling CD40 ligand ses at stige firedoblet fra 902, 000 til 3,63 millioner pr milliliter over en periode på seks dage. Celle levedygtighed er også væsentligt forbedret i overværelse af kylling CD40 ligand.I repræsentative konfokale mikroskopi billeder, er inficerede celler ses at have en grøn fluorescens omkring kernen, hvilket er i overensstemmelse med tilstedeværelsen af IBDV i cytoplasmaet. Dette er tydeligt for to stammer af IBDV, en celle-kultur tilpasset stamme, D78, og en meget ondartet stamme, UK661. RNA udvindes derefter ved fem, 18, 24 og 48 timer efter infektionen og udsættes for RT-qPCR med primere, der er specifikke for en bevaret region af IBDV VP4-genet.IBDV VP4 udtryk ses at stige til 16, 603 eksemplarer på 48 timer efter infektion med D78 og til 38, 632 eksemplarer på 48 timer efterinfektion med UK661. Disse data viser, at kylling primære bursal celler kan støtte replikation af celle-kultur-tilpasset og meget virulent IBDV stammer. Efter denne procedure kan andre metoder som RT-qPCR, microarray eller RNA-Seq udføres for at besvare yderligere spørgsmål, såsom hvordan cellerne reagerer på infektionen.Vi har sammenlignet, hvordan cellerne reagerer på infektion med en svækket stamme og en meget ondartet stamme af IBDV og vores nu undersøge, hvordan de reagerer på andre virusinfektioner. Evnen til at kultur disse celler giver os mulighed for at studere aspekter af virus patogenese og immunsuppression uden behov for at inficere fugle. Dette vil have en betydelig indvirkning på de tre R'er, udskiftning, raffinering og reduktion af brugen af dyr i forskning.

En Ex Vivo kylling primære Bursal-cellekultur Model til at studere smitsomme Bursal Disease Virus patogenese

Abstract