Affinitet rensning af grønkorn Translocon Protein komplekser ved hjælp af tryk på Tag

Grønkorn Biogenese kræver import af tusindvis af kerne-kodet proteiner i plastid. Import af disse proteiner, afhænger af translocon på den ydre (TOC) og indre (TIC) grønkorn membraner. Indholdsfortegnelsen og TIC komplekser er multimeriske og indeholder sandsynligvis endnu ukendt komponenter. En af de vigtigste mål i feltet er den komplette fortegnelse over indholdsfortegnelsen og TIC komponenter. Til isolering af TOC-TIC komplekser og identifikation af nye komponenter ændret den preprotein receptor TOC159 har været N-terminalt ved tilsætning af tandem affinitet rensning (TAP) tag resulterer i TAP-TOC159. TAP-tag er designet til to sekventielle affinitet rensning trin (dermed "tandem affinitet"). TAP-tag bruges i disse undersøgelser består af en N-terminale IgG-bindende domæne afledt af Staphylococcus aureus Protein en (ProtA) efterfulgt af en calmodulin-bindende peptid (CBP). Mellem disse to affinitet tags, en tobak etch virus (TEV) protease kavalergang websted er medtaget. Derfor, TEV protease kan bruges til blid eluering af TOC159-holdige komplekser efter binding til IgG perler. I protokollen præsenteres her, var det andet Calmodulin-affinity rensning skridt udeladt. Rensning-protokollen starter med forberedelse og oploesning af samlede cellemembraner. Efter vaskemiddel-behandling inkuberes solubilized Membranproteiner med IgG perler for immunoisolation af TAP-TOC159-holdige komplekser. Bindende og omfattende vask, er TAP-TOC159 indeholdende komplekser kløvet og frigivet fra IgG perlerne ved hjælp af TEV protease hvorved S. aureus IgG-bindende domæne er fjernet. Western blotting af den isolerede TOC159-holdige komplekser kan bruges til at bekræfte tilstedeværelsen af kendt eller formodet TOC og TIC proteiner. Endnu vigtigere, har de TOC159-holdige komplekser været anvendt med succes til at identificere nye komponenter til indholdsfortegnelsen og TIC komplekser af massespektrometri. Den protokol, som vi præsenterer potentielt giver effektiv isolering af enhver membran-bundet protein kompleks skal bruges til identifikation af endnu ukendte komponenter af massespektrometri.