Abstract
Biochemistry
Proteínas filamentosas como vimentina fornecem organização dentro das células, fornecendo um andaime estrutural com sites que ligam proteínas contendo plakin repete. Aqui, um protocolo para a detecção e medição de tais interações é descrito usando o domínio globular plakin de envoplakin e a bobina helicoidal da vimentina. Isto fornece uma base para determinar se uma proteína liga vimentina (ou proteínas filamentosas semelhantes) e medição da afinidade da interação. A proteína globular de interesse é rotulada com 15N e titulada com proteína vimentina em solução. Um espectro de NMR bidimensional é adquirido para detectar interações observando alterações na forma de pico ou mudanças químicas e para elucidar os efeitos das condições de solução, incluindo os níveis de sal, que influenciam a estrutura quaternária vimentina. Se a proteína de interesse vincula o ligante filamentoso, a interação de ligação é quantificada pelo MST usando as proteínas purified. A abordagem é uma maneira simples para determinar se uma proteína de interesse vincula um filamento e avaliar como alterações, tais como mutações ou condições de solução, afetam a interação.
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