Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Proteínas filamentosas como vimentina fornecem organização dentro das células, fornecendo um andaime estrutural com sites que ligam proteínas contendo plakin repete. Aqui, um protocolo para a detecção e medição de tais interações é descrito usando o domínio globular plakin de envoplakin e a bobina helicoidal da vimentina. Isto fornece uma base para determinar se uma proteína liga vimentina (ou proteínas filamentosas semelhantes) e medição da afinidade da interação. A proteína globular de interesse é rotulada com ¹⁵N e titulada com proteína vimentina em solução. Um espectro de NMR bidimensional é adquirido para detectar interações observando alterações na forma de pico ou mudanças químicas e para elucidar os efeitos das condições de solução, incluindo os níveis de sal, que influenciam a estrutura quaternária vimentina. Se a proteína de interesse vincula o ligante filamentoso, a interação de ligação é quantificada pelo MST usando as proteínas purified. A abordagem é uma maneira simples para determinar se uma proteína de interesse vincula um filamento e avaliar como alterações, tais como mutações ou condições de solução, afetam a interação.