可视化和跟踪活果蝇黑色素细胞卵室的内源性 mRNA

基于荧光的成像技术,结合光显微镜的发展,彻底改变了细胞生物学家进行活细胞成像研究的方式。自从开创性研究将位点特异性mRNA定位与基因表达调控联系起来以来,检测RNA的方法已经大大扩展。动态 mRNA 过程现在可以通过检测 mRNA 的方法进行可视化,再加上足够快的显微镜设置,可以捕获分子行为的动态范围。分子信标技术是一种基于杂交的方法,能够直接检测活细胞中的内源性转录。分子信标是发夹状、内部淬火、单核苷酸鉴别核酸探针,只有在杂交到独特的靶序列时才会产生荧光。当与先进的荧光显微镜和高分辨率成像相结合时,它们使人们能够对mRNA的细胞内运动进行空间和时间跟踪。虽然这项技术是能够检测内源转录本的唯一方法,但由于在设计活细胞成像的此类探针方面有困难,细胞生物学家尚未完全接受这项技术。一种新的软件应用程序PinMol,允许增强和快速设计的探头最适合有效地杂交到活细胞内的mRNA目标区域。此外,高分辨率、实时图像采集和当前开源图像分析软件可实现精细的数据输出,从而更精细地评估 mRNA 生命周期中涉及的动态过程的复杂性。

在这里,我们提出了一个全面的协议,用于设计和交付分子信标到果蝇黑色素细胞的卵子室。通过旋转盘共聚焦显微镜对内源性母体mRNA进行直接和高度特异性的检测和可视化。成像数据使用冰面软件中的物体检测和跟踪进行处理和分析,以获取有关 mRNA 动态移动的详细信息,mRNA 被传输并本地化到卵母细胞内的专门区域。