Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

Quinase e pyrophosphokinase enzimas transferir o fosfato gama ou a fracção de pirofosfato de beta-gama de precursores de nucleotídeo trifosfato para substratos para criar produtos fosforilados. O uso de γ -³²- P rotulado precursores NTP permite a monitorização simultânea de formação de produto e utilização de substrato por radiografia. Cromatografia em camada fina (TLC) em placas de celulose permite a separação rápida e sensível quantificação do substrato e produto. Apresentamos um método para a utilização da cromatografia de camada fina para analisar a atividade de pyrophosphokinase de uma sintetase de ppGpp purificado (p). Este método anteriormente foi usado para caracterizar a atividade de sintetases nucleotídeo e dinucleótido cíclicas e é amplamente apropriado para caracterizar a atividade de uma enzima que hidrolisa um vínculo de trifosfato de nucleotídeos ou transfere um terminal fosfato de um doador de fosfato para outra molécula.