Forfatterne vil gerne takke Prof. Dr. Stephan Beck og Prof. Dr. Jovica Ninkovic for deres input, hjælp og støtte i udviklingen af STAgR metoden. Tobias Klötzer, Anna Köferle og Valentin Baumann til nyttige kommentarer. Arbejdet er blevet støttet af DFG (STR 1385/1-1).

1. design af STAgR kloning strategi
<ol><li>Beslutte, hvor mange gRNA kassetter vil være inkluderet i ét udtryk vektor og i hvilken rækkefølge. Bestemme hvilket initiativtagerne og gRNA stilladser skal bruges til hver af gRNAs. Design af gRNAs ved hjælp af enhver online værktøj (f.eks. www.benchling.com).</li>
</ol>2. design af STAgR kloning primere med udhæng
Bemærk: Den følelse protospacer sekvens af den sidste gRNA og antisensstoffer af den første gRNA henholdsvis føjes til PCR primere anvendes til forstærkning af vektor rygraden (figur 1). De resterende sekvenser er amplificeret fra de strenge, som derved fastgørelse af fornuft og antisense gRNAs i den ønskede rækkefølge. Den første streng stykke er forstærket med en fremad primer, der indeholder den første gRNA N20 sekvens som et udhæng og en reverse primer med den anden gRNA N20 sekvens (reverse supplement) som et udhæng. Alle de følgende stykker genereres i overensstemmelse hermed.
<ol><li>Tilføje N20 gRNA sekvenser til de forreste forstærkning primere for STAgR DNA strengen som hænger ud (tabel 1). Tilføje forstand gRNA sekvenser 5' fremad primer "scf-FP" (for et konventionelt stillads) eller "sam-FP" (for en MS2 indeholdende stillads). FP primere anneal til stillads/MS2 del af de respektive STAgR streng (figur 1).</li>
	<li>Tilføje det omvendte supplement N20 gRNA sekvens til reverse primer sekvenser. Vælg RP primere afhængigt af den specifikke initiativtagere og strygere anvendes (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).</li>
</ol>3. generation af STAgR kloning fragmenter
<ol><li>For at generere de enkelte kloning fragmenter for Gibson forsamling, udføre PCR'er ved at oprette 10 µL af high fidelity (HF) buffer, 1 µL af 10 mM dNTP'er, 0,25 µL af overhæng-primer (100 µM), 10 ng af DNA-skabelon (streng eller vektor), 0,5 µL HF polymerase , 1,5 µL af dimethylsulfoxid (DMSO) og tilføje H2O for at gøre en endelige mængden af 50 µL. Bemærk: Brug plasmid "STAgR_Neo" som en skabelon for rygraden PCR til at optage gRNA stillads til den sidste gRNA, hvis SAM Scaffold er valgt, skal du bruge "STAgR_SAM". For en STAgR plasmid med seks gRNA kassetter for eksempel er seks PCR'er nødvendige, fem med DNA strenge som skabeloner og en med vektor rygraden som skabelon.</li>
	<li>Inkuber reaktioner på en thermocycler ved hjælp af følgende betingelser: 1 cyklus af 98 ° C i 1 min. 30 s; 38 cyklusser af 98 ° C til 10 s, 59 ° C (for gRNA stillads) / 68 ° C (for SAM loop) for 10 s, 72 ° C i 30 s (for indstik) / 1 min. 30 s (for vektorer); 1 cyklus ved 72 ° C i 10 min.</li>
	<li>Fjern 5,5 µL fra PCR reaktion, tilføje lastning farvestof og analysere de forstærkede fragmenter på en 1%-agarosegel. Indlæs en passende DNA ladder for dimensionering (100 bp DNA ladder/1 kb DNA ladder) og Kør gelen i et passende gel kørende buffer (fx, TLE buffer) på 120 V i 30 min.</li>
	<li>Mens gelen kører, tilsæt 5 µL af bufferen med restriktion enzymet og 0,5 µL DpnI (10 enheder) til den resterende 44,5 µL PCR reaktion og Inkuber i 30 min. til 1 time ved 37 ° C.</li>
	<li>Udføre DNA oprensning ved hjælp af magnetiske perler.<ol>
<li>Tilføje 1,8 µL magnetiske perler pr. 1 µL PCR produkt og mix af pipettering op og ned. Der inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur (RT).</li>
		<li>Adskille perler og DNA fragmenter fra resterende væske med en magnet. Vaske perlerne to gange med 70% ethanol ved at skylle pelleten uden resuspending helt.</li>
		<li>Fjern alle ethanol med en pipette og lad pellet lufttørre.</li>
		<li>Opløses træpiller i 15 – 20 µL H2O ved pipettering op og ned og adskille perler fra væsken ved hjælp af en magnet. Overføre klart supernatanten til en ny tube. Bemærk: Alternativt kolonne-baserede reaktion oprydning kits kan bruges.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestemme DNA koncentrationer ved hjælp af et spektrofotometer som beskrevet andetsteds29.</li>
</ol>4. Gibson forsamling reaktion og bakteriel omdannelse
Bemærk: Følgende trin er tilpasset fra Gibson et al. 30.
<ol><li>Forberede en hjemmelavet Gibson reaktion mix eller bruge en kommerciel Gibson kloning kit.<ol>
<li>Kombiner 3 mL 1 M Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane)-HCl på pH 7,5, 300 µL 1 M MgCl, 60 µL af 100 mM dGTP (deoxyguanosine trifosfat), 60 µL af 100 mM dATP (deoxyadenosine trifosfat), 60 µL af 100 mM dTTP (deoxythymidine trifosfat), 60 µL af 100 mM () dCTP deoxycytidine trifosfat), 300 µL 1 m DTT (dithiothreitol), 1,5 g PIND-8000 (polyethylen glycol), 300 µL af 100 mM NAD (nicotinamid-adenin-dinucleotid) og tilføje H2O for at få 6 mL 5 × isotermisk reaktion buffer. Bemærk: Aliquoted buffer kan opbevares ved-20 ° C i mindst 12 måneder.</li>
		<li>For Gibson forsamling master mix, kombinere 320 µL af 5 x isotermisk reaktion buffer med 697 µL af H2O og tilsæt 3 µL af 10 U/µL T5 exonuclease, 20 µL af 2 U/µL DNA polymerase og 160 µL af 40 U/µL Taq DNA ligase. Bemærk: Denne blanding kan være aliquoted og opbevares ved-20 ° C i mindst 12 måneder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruge 7,5 µL af forsamling master mix med 2,5 µL af Indsæt og vektor. Bruge en kindtand vektor indsætte forholdet 1:1, men ikke mere end 0,2 pmol af DNA i alt 2 x STAgR reaktioner. For mere end 2 gRNA udtryk kassetter, bruge en vektor indsætte forholdet 1:3, men højst en samlede 0,5 pmol-DNA. Bemærk: Alle forstærket gRNA udtryk kassetter bør anvendes i equimolar mængder. Omfatte et plasmid kontrol med identiske mængden af vektor men ingen skær til kontrol for ufordøjet skabelon vektor (og/eller selvstændig ligatur).</li>
	<li>Inkuber prøver ved 50 ° C i 45-60 min. butik prøver på is eller ved-20 ° C for efterfølgende transformation. Bemærk: Protokollen kan pause her.</li>
	<li>Direkte omdanne halvdelen af blandingen i kemisk kompetente bakterier.<ol>
<li>Tø kemisk kompetente TOP10 E. coli bakterier på is.</li>
		<li>Tilføj 5 µL af Gibson mix til 50 µL af kompetente bakterier. Bland forsigtigt ved at bladre i bunden af røret. Der inkuberes i isbad i 30 min.</li>
		<li>Udføre en heat shock ved at placere røret i en 42 ° C vandbad eller en varme blok for 45 s.</li>
		<li>Sætte rørene tilbage på isen. Tilføje 250 µL af SOC medium for bakterier og lad dem inddrive ved 37 ° C i en rystende inkubator for 30-45 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efter inddrivelsen plade de transformerede bakterier på 1,5% lysogeny bouillon (LB) agar plader der indeholder ampicillin (100 µg / mL), og der inkuberes natten over ved 37 ° C.</li>
</ol>5. valg af STAgR kloner af bakteriel koloni PCR
<ol><li>Forberede mindst to sæt af 200 µL PCR reaktion rør (mellem 3 og 24) til hver konstruktion, som er mærket identisk.</li>
	<li>Fyld det ene sæt med 100 µL LB medium indeholdende 100 µg / mL ampicillin.</li>
	<li>Brug en steril pipette tip til at skrabe det biologiske materiale af en bakteriel koloni og sprede det nederst i den tomme 100 µL PCR reaktion tube. Straks overføre spidsen til det andet tilsvarende reaktion rør indeholdende LB-medie.</li>
	<li>Swirl tip omkring forsigtigt for at sikre nogle af bakterierne overføres til LB medier og inkuberes ved 37 ° C til senere brug.</li>
	<li>Oprette en PCR master mix (10 µL pr. reaktion).<ol>
<li>For 10 reaktioner, kombinere 10 µL Taq buffer, 2 µL 10 mM dNTP'er, 0,5 µL af primer (100 µM), 0,5 µL af Taq -polymerase og tilføje H2O til et volumen på 100 µL.</li>
		<li>Brug de følgende primere: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tilføje 10 µL PCR master mix til mærket PCR reaktion rør uden LB-medie.</li>
	<li>Inkuber reaktioner på en thermocycler ved hjælp af følgende betingelser: 1 cyklus af 94 ° C i 5 min, 38 cyklusser af 94 ° C til 30 s, 55 ° C til 30 s, 72 ° C i 2 min. 1 cyklus ved 72 ° C i 10 min. Bemærk: Brudforlængelse tid (72 ° C trin) bør øges med antallet af gRNA udtryk kassetter. Beregnes teoretisk størrelse af skær ved hjælp af tabel 2 og bruge 1 min pr. 1 kb på 72 ° C.</li>
	<li>Tilføje lastning farvestof og analysere de forstærkede fragmenter på en 1%-agarosegel. Indlæse en passende DNA ladder for dimensionering (1kb DNA Ladder) og køre den i passende gel kører buffer (fxTLE Buffer) på 120 V i 30 min.</li>
	<li>Beregne amplikonen teoretisk størrelse ved hjælp af tabel 2 ved at addere de enkelte størrelser af brugte initiativtagere, gRNA stilladser og antallet af N20 sekvenser. Fra resultaterne af kolonien PCR, identificere de bakterielle kloner baseret på korrekte band størrelse og om de er tilbøjelige til at havnen korrekte vektorer.</li>
	<li>Podes en 2,5 mL overnight LB kultur (med 100 µg/mL ampicillin) med de tilsvarende 100 µL kultur, oprettet tidligere. Der inkuberes ved 37 ° C i 12 timer.</li>
	<li>Uddrag plasmid DNA ved hjælp af en kommerciel plasmid mini kit og producentens instruktioner31.</li>
	<li>Sekvens plasmider ved hjælp af de følgende primere: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) og StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) af Sanger sekvensering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+CRISPR-Cas+immune+systems+and+molecular+machines.">Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines.</a> Genome Biol. 16, 247 (2015).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Based+Engineering+of+the+Epigenome.">CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).</li><li>K&#246;ferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brave+new+epigenomes:+the+dawn+of+epigenetic+engineering.">Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering.</a> Genome Med. 7 (1), 59 (2015).</li><li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+profiles+to+function+in+epigenomics.">From profiles to function in epigenomics.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+and+reversion+of+chromosomal+translocations+using+CRISPR/Cas+technology.">Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology.</a> BMC Genomics. 17 (1), 739 (2016).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+site-specific+chromosomal+translocations+in+embryonic+stem+cells+by+CRISPR/Cas9.">Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 6, 21918 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+genomic+fragment+deletion+and+functional+gene+cassette+knock-in+via+Cas9+protein+mediated+genome+editing+in+one-cell+rodent+embryos.">Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos.</a> Scientific Reports. 5, 17517 (2015).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+genomic+fragment+deletions+and+insertions+in+mouse+using+CRISPR/Cas9.">Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0120396 (2015).</li><li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+modification+by+CRISPR-Cas9+nickase+with+minimal+off-target+effects.">Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects.</a> Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+evolving+homing+CRISPR+barcodes.">Rapidly evolving homing CRISPR barcodes.</a> Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming.">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li><li>Bultmann, S., Stricker, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+post-epigenomic+age:+back+to+epigenetics.">Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics.</a> Open Biology. 8 (3), (2018).</li><li>Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+stop+for+the+CRISPR+revolution:+RNA+guided+epigenetic+regulators.">Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators.</a> FEBS Journal. , (2016).</li><li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR/Cas9+system.">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li><li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems.">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Wrighton, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+Multiplex+genome+engineering+in+eukaryotes.">Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).</li><li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+engineering+enhanced+by+Drosha-mediated+sgRNA-shRNA+structure.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure.</a> Scientific Reports. 6, 38970 (2016).</li><li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Research. 42 (19), 147 (2014).</li><li>Cress, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPathBrick:+Modular+Combinatorial+Assembly+of+Type+II-A+CRISPR+Arrays+for+dCas9-Mediated+Multiplex+Transcriptional+Repression+in+E.+coli.">CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).</li><li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs.">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li><li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+(STAgR).">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS ONE. 13 (4), 0196015 (2018).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (1982).</li><li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORALINA:+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening.">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917 (2016).</li><li>Koferle, A., Stricker, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+Protocol+for+Large-scale+gRNA+Library+Production+from+any+DNA+Source.">A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56264 (2017).</li><li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries.">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083 (2015).</li><li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR/Cas9+vector+system.">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Scientific Reports. 4, 5400 (2014).</li><li>Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boosting+CRISPR/Cas9+multiplex+editing+capability+with+the+endogenous+tRNA-processing+system.">Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Her præsenterer vi en detaljeret protokol for STAgR giver mulighed for hurtig og enkel generation af gRNA udtryk plasmider i varierende størrelser. Denne protokol kan bruges til et-trins generation af gRNA plasmider med 2 – 8 gRNA udtryk kassetter (med eller uden to MS2 RNA aptamers) i gRNA udtryk vektor STAgR_Neo og anvendelse af menneskelige U6, mus U6, menneskers 7sK og menneskelige H1 initiativtagere28 ,32,33. Hvis mere end fire kassetter er ønsket, anbefales det at bruge mindst to forskellige promotor/stillads typer til at øge effektiviteten. Andre vektorer, initiativtagere og promotor kombinationer samt mere end 8 gRNA kassetter kan være realistisk så godt; dog er dette ikke blevet testet. Selvom vores erfaring metoden fungerer pålideligt og reproducerbar, vi har bestemt kritisk trin og fejlfinding strategier bør det forventede resultat ikke umiddelbart forekomme. I vores erfaring nogle trin er afgørende for succes af tilgangen: først og fremmest, det er vigtigt at bruge de korrekte molære forhold af skær til vektor rygraden på Gibson forsamling trin (3:1). Vi bemærkede imidlertid, at for nogle gRNA sæt forholdet 1:1 af skær til vektor er gavnlige, selv når gRNA kassette antallet overstiger to. For det andet, perioden af Gibson forsamling reaktion bør være tilstrækkelig lang (mindst 45 min anbefales).
STAgR kan være ansat med et stort antal ændringer. Målretning sekvenser, gRNA kan numre og stilladser, initiativtagere og vektor backbones tilpasset og frit kombineres. Hver kombination kan dog lidt anderledes krav. Vores erfaring, hvis medium eller høj numre af gRNA kassetter (> 4) er ønsket, men ikke opnået straks, normalt den hurtigste måde at overvinde dette problem er at ændre rækkefølgen af de enkelte gRNA kassetter i vektoren. På samme måde, ved at kombinere forskellige gRNA initiativtagere og stilladser forbedrer effektiviteten (og dermed sænker det krævede antal koloni PCR'er, der har at blive scoret) hvor mange gRNA kassetter er klonet. Vi fandt, at forkert kloner af den spontane sammen af gentagne sekvenser genereres normalt under Gibson forsamling. Selv om dette kan reducere effektiviteten af metoden, resulterer det også i den samtidige generation af vektorer med funktionelle gRNA delmængder28.
Generation af multiplexing gRNA vektorer som indeholder mere end én gRNA udtryk kassette er blevet rapporteret med en række forskellige metoder21,22,23,24,25, 26,27. Mens nogle anvender samtidige eller sekventiel kloning af gRNA par22,34, afhænger andre af Golden Gate forsamling og flere sekventielle kloning trin25,35. En særlig tilgang er blevet brugt af Xie et al., ved at ansætte den endogene cellulære tRNA forarbejdningssystemet at skære flere gRNAs ud af en enkelt stamfader udskrift36. Advangetage af denne metode er kravet om kun én promotor; Ulempen er behovet for nyligt syntetiserede DNA fragmenter for hver gRNA kombination. Hver gRNA multiplexing metode har fordele og ulemper; STAgR kombinerer enkelhed med effektivitet, høj antallet af mulige gRNA kassetter med lave omkostninger.
STAgR (og andre multiplexing systemer) vil sandsynligvis være medvirkende til at aktivere effektiv (og samtidige) afbrydelse af flere gener i vivo, som var pioner i zebrafisk hjerner28. En anden fremtidig anvendelse af gRNA multiplexing vektorer er lovende for manipulation af komplet transcriptional programmer i modsætning til induktion eller undertrykkelse af enkelt gener. Sandsynligt, disse tilgange giver mulighed for omdanne celler og organer på vil i langt højere grad end det er muligt i dag.

Streng forsamling gRNA kloning (STAgR) er et middel, der muliggør effektiv overnight generation udtryk vektorer der indeholder flere gRNA udtryk kassetter i én enkelt kloning trin. STAgR-protokollen afhænger ikke af specialist ekspertise eller materialer og tilbyder flere muligheder for tilpasning.
Den bakterielle CRISPR protein Cas9 har en enestående kapacitet. Det er i stand til at finde og selektivt binde kun disse DNA-sekvenser kodet i naturligt forekommende crRNAs eller manipuleret gRNAs1. Dens udnyttelse som en molekylær værktøj har muliggjort en lang række tilgange, der var umuligt, umuligt eller kun begrænset til visse cellulære modeller indtil for nylig. Disse omfatter målrettede gen mutationer2, genom engineering3, epigenome redigering4,5,6, transcriptional aktivering og genhæmning7,8. Så vidt vi ved CRISPR er universelt indsættelige, som rapporter fra dens anvendelse findes for en lang række målwebsteder, celletyper og arter. Men mange CRISPR programmer afhænger direkte eller indirekte levering af flere gRNAs, herunder en række genomisk manipulationer (omplantninger9,10, medium11 og storstilet genomisk ændringer 12 , 13), genom engineering (brug af Cas9 nickases14), generation af betingede alleler11,15 eller seriel mutationer16og sporing strategier17. Desuden, for andre tilgange (transcriptional engineering18, epigenome engineering19,20) flere målretning websteder ikke er strengt obligatoriske, men de når deres maksimale virkning ofte kun under denne betingelse.
Flere nyttige metoder er blevet beskrevet til at generere gRNA vektorer som indeholder mere end én gRNA udtryk kassette21,22,23,24,25,26, 27. Vi præsenterer her, en protokol for STAgR, string forsamling gRNA kloning, som er enestående i sin kombination af enkelhed og hastighed (kun én overnatning kloning trin er nødvendigt), lav pris (som DNA skabeloner kan genbruges flere gange), customizability (for forskellige gRNA systemer og promotorer) og effektivitet (det giver mulighed for generation af vektorer indeholdende højt antal gRNA kassetter)28.
STAgR kan principielt bruges til at generere udtryk vektorer med par (1-2 gRNAs), flere (3-5 gRNAs) og nogle af de højeste antal udtryk kassetter rapporteret hidtil (6 – 8 gRNAs)28. STAgR er ligeledes gældende for gRNA sekvens, rygraden eller promotor. Da imidlertid STAgR er hovedsageligt baseret på polymerase kædereaktion (PCR) og Gibson forsamling, skal gRNAs med høj sekvens ligheder genereres ved hjælp af en alternativ metode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:929px;" width="929">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Phusion High- Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:139px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0530L</td>
			<td style="width:403px;">Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">dNTPs</td>
			<td style="width:139px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">R0191</td>
			<td>dNTPs for all PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">dATP</td>
			<td style="width:139px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">R0141</td>
			<td>dNTPs for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">dCTP</td>
			<td style="width:139px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">R0151</td>
			<td>dNTPs for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">dGTP</td>
			<td style="width:139px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">R0161</td>
			<td>dNTPs for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">dTTP</td>
			<td style="width:139px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">R0171</td>
			<td>dNTPs for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">443666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DpnI</td>
			<td style="width:139px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:139px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63881</td>
			<td>for DNA clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris HCL</td>
			<td style="width:139px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">9090.2</td>
			<td>for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DTT</td>
			<td style="width:139px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">PEG 8000</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">RC- 077</td>
			<td>for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">NAD</td>
			<td style="width:139px;">Cayman Chemicals Company</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16077</td>
			<td>for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">T5 Exonuclease</td>
			<td style="width:139px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0363S</td>
			<td>for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Taq DNA Ligase</td>
			<td style="width:139px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208S</td>
			<td>for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:119px;">PHR1393-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DNA Ladder 1kb Plus</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plasmid Mini Kit</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Plasmid and Primer Sequences</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">EDTA</td>
			<td style="width:139px;">PanReacAppliChem</td>
			<td style="width:119px;">6381-92-6</td>
			<td>for TLE Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:269px;">MgCl2</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td>for Gibson Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Top10 chemically competent bacteria</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C404003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">S.O.C. Medium</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Yeast- Extract</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td>for lysogenic broth (LB Media)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>for lysogenic broth (LB Media)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Peptone</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">91249</td>
			<td>for lysogenic broth (LB Media)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Agar-Agar</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5040</td>
			<td>for lysogenic broth (LB Media)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:139px;">Quiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">201203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable protocol for string assembly grna cloning (stagr)

Bakteriel CRISPR/Cas9 systemet er steget betydeligt metodiske muligheder for liv forskere. På grund af dens udnyttelse blev genetiske og genomiske engineering gældende for en lang række systemer. Desuden, mange transcriptional og epigenomiske engineering tilgange er nu generelt muligt for første gang. En af grundene til den brede anvendelse af CRISPR ligger i den todelte karakter. Små gRNAs bestemme genomisk målene i komplekset, varianter af protein Cas9 og de lokale molekylære konsekvenser. Mange CRISPR tilgange afhænger imidlertid af den samtidige levering af flere gRNAs i enkelte celler. Her præsenterer vi en tilpasselig protokol for streng forsamling gRNA kloning (STAgR), en metode, der giver mulighed for enkel, hurtig og effektiv generation af multipleksede gRNA udtryk vektorer i en enkelt kloning trin. STAgR er omkostningseffektive, siden (i denne protokol) de individuelle målretning sekvenser er indført af korte udhæng primere, mens de lange DNA skabeloner af gRNA udtryk kassetter kan genanvendes flere gange. Desuden tillader STAgR trinvist inkorporering af et stort antal gRNAs samt kombinationer af forskellige gRNA varianter, vektorer og initiativtagere.

Efter protokol ved hånden gør generation af tilpassede multiplexing gRNA vektorer muligt (figur 1). Repræsentative resultater af STAgR tilgange ved hjælp af seks forskellige gRNA kassetter er afbildet i figur 2. Figur 2 A viser et typisk resultat af PCR'er bruges til at opnå STAgR stykkerne (protokol 3.1-3.3). Seks amplikoner (BB, S1-S5) repræsenterer lineære DNA stykker der indeholder de enkelte gRNA N20 sekvenser på enderne. Plasmid rygraden (BB) er nu udvidet med målretning sekvenser af gRNA1 og gRNA6 og derfor besidder de nødvendige overlap til to andre PCR'er (S1 og S5) for Gibson Forsamling (figur 2A, tabel 3). Efter rensning kan der opnås et DNA udbytte af mindst 1 µg for vektorer og skær.
Efter Gibson forsamling, bør bakteriel transformation resultere i 100 til 700 bakteriel kolonier. Figur 2 B viser en repræsentativ analyse af 10 bakteriel kolonier via koloni PCR, efter en STAgR protokol med seks gRNA kassetter. Gelelektroforese angiver, at tre kloner viser den forventede amplikon størrelse for fuld Forsamling (tabel 2). Andre kloner sandsynligvis modtaget STAgR vektorer indeholdende et til fem gRNA kassetter, hvorimod en klon (figur 2B, No.18) er tomme.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg"> Figur 1 : Oversigt over STAgR primer design. Første gRNA antallet og stilladser er valgt, så gRNA ordre og promotor og sidste, hvilken type af vektor bør anvendes. For hver gRNA, er en specifik fremad primer med gRNA målretning sekvens i forstand orientering og den fælles del af "scf-FP" eller "sam-FP" designet. På samme måde, for at generere den enkelte omvendt primer tilsvarende promotor sekvensen (RP) er sammenvokset med det omvendte supplement af N20 sekvens af den næste gRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg"> Figur 2 : Repræsentative resultater af STAgR tilgange ved hjælp af seks forskellige gRNA kassetter. (A) repræsentative eksempel på en PCR af fem skær samt vektor STAgR_Tomato. (B) koloni PCR af en 6 x STAgR reaktion ved hjælp af hU6 og mU6 projektledere og kanoniske gRNA samt SAM stilladser. 22 bakteriel kolonier blev analyseret, hvoraf 7 viste den forventede band der angiver komplet enhed. Stigen: 1 kb plus, numre i basepar (bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Sende primer for streng og vektor</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Omvendt primer for streng og vektor</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Primer sekvenser for gRNA stilladser og initiativtagere.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Størrelser af initiativtagerne og stilladser.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK</td>
			<td>245 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA stillads</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAMloop + gRNA stillads</td>
			<td>143 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Teoretiske størrelser af hvert udtryk kassette til at beregne koloni PCR resultatet.
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 bp</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>3722 bp</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Størrelser af initiativtagerne og stilladser.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+74 bp</td>
			<td>67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>428 bp</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: Beregnede størrelser af STAgR stykker efter PCR.

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR at JoVE.com

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

En tilpasselig protokol for streng forsamling gRNA kloning (STAgR)

Vi præsenterer her, streng forsamling gRNA kloning (STAgR), en metode til let multiplex gRNA vektorer for CRISPR/Cas9 tilgange. STAgR gør gRNA multiplexing enkle, effektive og kan tilpasses.

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Det bakterielle CRISPR-Cas9-system har øget forsøgsmulighederne betydeligt for life scientists. Flere CRISPR-tilgange afhænger imidlertid af samtidig levering af flere guide-RNA'er i individuelle celler. Strengsamlingsgrna-kloning giver mulighed for enkel og hurtig generering af multiplex gRNA-ekspressionsvektorer i et enkelt kloningstrin.Men STAgR er ikke kun enkel, det er også effektivt, billigt og nemt at tilpasse. Til at begynde med skal du tilføje N20 gRNA-sekvenserne til de forreste forstærkningsprimere til STAgR DNA-strengen som udhæng. Tilføj sense gRNA sekvenser fem prime til den forreste primer, Stillads frem primer, for en konventionel stillads, eller til SAM frem primer for en MS2-holdige stillads.Dernæst tilføje den omvendte supplement N20 gRNA sekvenser til den omvendte primer sekvenser, vælge RP primere, afhængigt af de specifikke initiativtagere og strygere, der anvendes. For at begynde at generere de enkelte kloningsfragmenter til Gibson Assembly, skal du overføre 10 mikroliter af high-fidelity bufferen til et rør. Tilføj en mikroliter af 10 milimolar dNTPs og 0,25 mikroliter af begge 100 mikromolar udhæng primere.Tilføj 10 nanogram af DNA-skabelonstrengen eller -vektoren og 1,5 mikroliter DMSO. Tilsæt vand nok til at bringe det endelige volumen til 49,5 mikroliter, og tilsæt derefter 0,5 mikroliter HF polymerase. Inkuber reaktionerne på en termocyr, som beskrevet i tekstprotokollen.Efter dette, tage en 5,5 mikroliter aliquot fra PCR reaktion. Tilføj lastning farvestof til alle aliquots, og indlæse det på en 1%agarose gel. Læg en passende DNA-stige til dimensionering, og kør gelen i en passende gel-løbende buffer ved 120 volt i 30 minutter.Mens gelen kører, tilsættes fem mikroliter af bufferen, der er forsynet med restenzymet, og 0,5 mikroliter DpnI til de resterende 44,5 mikroliter vektor-PCR-reaktion for at fjerne den resterende plasmidskabelon, der anvendes under PCR. Inkubere ved 37 grader Celsius i 30 til 60 minutter. Kontroller, at ampliconerne har den korrekte størrelse.For at begynde DNA rensning, tilsæt 1,8 mikroliter af magnetiske perler pr en mikroliter PCR produkt, og bland ved pipettering op og ned. Inkuber ved stuetemperatur i to minutter. Ved hjælp af en magnet skal perlerne adskilles i DNA-fragmenter fra den resterende væske.Skyl pellet med 70% ethanol uden fuldt resuspending det, at vaske perlerne. Gentag denne vask en ekstra gang. Ved hjælp af en pipette, fjerne alle ethanol og lad pellet luft tørre.Derefter tilsættes 15 til 20 mikroliter vand, og pipette op og ned for at blande og opløse pellet. Brug en magnet til at adskille perlerne fra væsken. Overfør den klare supernatant til et nyt rør.Derefter skal du bruge et spektrofotometer til at bestemme DNA-koncentrationerne. Først forberede 5x isotermisk reaktion buffer som beskrevet i tekstprotokollen. For Gibson Assembly Master Mix, kombinere 320 mikroliter af 5x isotermisk reaktion buffer med 697 mikroliter vand.Der tilsættes 3 mikroliter T5 exonuclease, 20 mikroliter DNA-polymerase og 160 mcirolitere af Taq DNA-ligase. Overfør 7,5 mikroliter af Assembly Master Mix til et frisk rør. Tilføj derefter 2,5 mikroliter af skær i vektor, som beskrevet i tekstprotokollen.Inkuber prøverne ved 50 grader Celsius i 45 til 60 minutter. Derefter opbevares prøver på is eller ved 20 grader Celsius til efterfølgende omdannelse. Når du er klar til at omdanne bakterierne, tø kemisk kompetente TOP10 E.Coli bakterier på is.Dernæst tilsættes fem mikroliter af Gibson Mix til 50 mikroliter af kompetente bakterier, og bland ved forsigtigt at svippe bunden af røret. Inkuber på is i 30 minutter. Placer røret i en 42 grader Celsius vandbad eller varmeblok i 45 sekunder for at varme-chok bakterierne.Sæt derefter rørene tilbage på is. Tilsæt 250 mikroliter AF SOC medium til bakterierne, og lad dem komme sig ved 37 grader Celsius i en rystende inkubator i 30 til 45 minutter. Efter bakterierne er kommet sig, plade dem på 1.5%LB Agar plader, der indeholder 100 mikrogram pr milliliter ampicillin.Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius i løbet af natten. Til at begynde, forberede mindst to sæt af 200 microliter PCR reaktionsrør for hver konstruktion. Fyld et af reaktionsrørene med 100 mikroliter LB-medium, der indeholder 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin.Ved hjælp af en steril pipettespids skal du ridse det biologiske materiale af fra en bakteriekoloni og sprede det i bunden af et tomt 200 mikroliter PCR-reaktionsrør. Overfør straks pipettespidsen til det andet tilsvarende reaktionsrør, der indeholder LB-mediet. Hvirvle spidsen rundt for at sikre, at nogle af bakterierne overføres til LB medierne.Inkubere ved 37 grader Celsius til senere brug. Derefter forberede 10 mikroliter AF PCR Master Mix pr reaktionsrør, som skitseret i tekstprotokollen. Tilføj 10 mikroliter af PCR Master Mix til de mærkede PCR-reaktionsrør uden LB-mediet.Ved hjælp af en termocyr inkuberes reaktionerne som beskrevet i tekstprotokollen. Efter dette, tilføje lastning farvestof til forstærkede fragmenter, og indlæse dem på en 1% agarose gel. Læg en passende DNA-stige til dimensionering, og kør gelen i en passende gel-løbende buffer ved 120 volt i 30 minutter.Beregn ampliconens teoretiske størrelse ved at lægge de individuelle størrelser af brugte initiativtagere, gRNA-stilladser og antal N20-sekvenser sammen. Fra resultaterne af kolonien PCR, identificere de bakterielle kloner, baseret på den korrekte båndstørrelse, og om de er tilbøjelige til at havnen korrekte vektorer. Ved hjælp af den tilsvarende 100 mikroliterkultur skal du vaccinere en 2,5 milliliter LB-kultur natten over, der indeholder 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin.Inkubere ved 37 grader Celsius i 12 timer. Brug derefter en kommerciel plasmid mini-kit til at udtrække plasmid DNA, i henhold til producentens anvisninger. I denne procedure bruges strengsamlingsgRNA-kloning til hurtigt at generere gRNA-udtryk plasmider.Et typisk resultat af de PCR'er, der anvendes til at opnå STAgR stykker ses her. De seks ampliconer repræsenterer lineære DNA-stykker, der hver indeholder de enkelte gRNA N20-sekvenser på deres ender. Den plasmid rygraden er udvidet med målretning sekvenser af gRNA1 og gRNA6, og derfor besidder de nødvendige overlapninger til to andre PCR'er for Gibson Assembly.Efter rensning kan der opnås et DNA-udbytte på mindst ét mikrogram til vektorer og skær. Efter Gibson Assembly, bakteriel transformation resulterer i 100 til 700 bakterielle kolonier. Repræsentativ analyse af 22 bakteriekolonier via koloni-PCR efter en STAgR-protokol med seks gRNA-kassetter indikerer, at syv kloner viser den forventede ampliconstørrelse for fuld montering.De andre kloner sandsynligvis modtaget STAgR vektorer, der indeholder en til fem gRNA kassetter, mens en klon er helt tom. Når mestrer, kan denne teknik gøres i et par timer. Udføres korrekt, det giver mulighed for generering af et væld af multiplex gRNA udtryk vektorer i mindre end en arbejdsuge.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at være opmærksom på den korrekte tildeling og kombination af N20 udhæng primere. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan du opretter din egen multiplex guide RNA udtryk vektorer.