Abstract
Genetics
Bakteriel CRISPR/Cas9 systemet er steget betydeligt metodiske muligheder for liv forskere. På grund af dens udnyttelse blev genetiske og genomiske engineering gældende for en lang række systemer. Desuden, mange transcriptional og epigenomiske engineering tilgange er nu generelt muligt for første gang. En af grundene til den brede anvendelse af CRISPR ligger i den todelte karakter. Små gRNAs bestemme genomisk målene i komplekset, varianter af protein Cas9 og de lokale molekylære konsekvenser. Mange CRISPR tilgange afhænger imidlertid af den samtidige levering af flere gRNAs i enkelte celler. Her præsenterer vi en tilpasselig protokol for streng forsamling gRNA kloning (STAgR), en metode, der giver mulighed for enkel, hurtig og effektiv generation af multipleksede gRNA udtryk vektorer i en enkelt kloning trin. STAgR er omkostningseffektive, siden (i denne protokol) de individuelle målretning sekvenser er indført af korte udhæng primere, mens de lange DNA skabeloner af gRNA udtryk kassetter kan genanvendes flere gange. Desuden tillader STAgR trinvist inkorporering af et stort antal gRNAs samt kombinationer af forskellige gRNA varianter, vektorer og initiativtagere.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved