Denne undersøgelse blev støttet af finansiering fra National Cancer Institute Grant CA-217833.

Alle undersøgelser, der involverer dyr, blev udført i overensstemmelse med en protokol, som blev godkendt af Mayo Clinic Institutionsudvalg for dyrepasning og-brug.
1. forberedelse af bænken
<ol><li>Forbered et vandbad og sæt det til 37 °C. Det andet nødvendige udstyr og opsætning er vist i figur 1.</li>
	<li>Mål 100 mg kollagenase type IV og tilsæt det til en 125 ml kolbe, der indeholder 100 ml hbss i et vandbad (40 °c). Sørg for, at kollagenase er opløst ved at hvirvle væsken i kolben, og Sørg også for, at kolben er helt nedsænket i vandbad. For større effektivitet, tillader kollagenase at opløse i mindst 30 minutter, selv om det kan synes at opløse øjeblikkeligt.</li>
	<li>En 125 mL kolbe, der indeholder 50 mL HBSS i et vandbad ved 40 °C, nedsænkes. Dette vil blive brugt til indledende træk.</li>
	<li>Spray ned overfladen af alle instrumenter såsom saks og pincet med 70% ethanol. Forbered nogle få rene vatpinde.</li>
	<li>Skyl slangen af pumpen ved at køre 70% ethanol gennem pumpen og fjern eventuel resterende ethanol ved at skylle det to gange med rindende vand.</li>
	<li>Læg en absorberende bænk på laboratorie bænken, og Placer en hård kasse beholder på toppen. Dette vil være nødvendigt at indeholde eventuelle overskydende væsker under musen perfusion. Wrap en polystyren skum pude med aluminiumsfolie og placere den inde i beholderen.</li>
	<li>Placer en steril 10 cm kultur skål tæt på bænken. Dette vil blive brugt til at holde den fordøjet leveren efter perfusion er afsluttet.</li>
	<li>Hæld 10 mL kollagenase medium (trin 1,2) i en steril kultur skål på forhånd.</li>
	<li>Ved hjælp af et bevinget blodindsamlingssæt skal du tilslutte 23-måleren til den frie ende af pumpeslangen (skæring af vingerne fra sommerfuglkanylen kan føre til bedre håndtering). Passere, indtil spidsen af kanylen på blod samlingen er fyldt.</li>
</ol>2. tilberedning af dyr
<ol><li>Før du starter anæstesi med isofluran, skal du sørge for, at der er en tilstrækkelig mængde gasforsyning til rådighed i hele procedurens varighed. Tænd oxygen (O2) forsyningen til induktions kammeret ved 1-2 L, og tænd derefter isofluran mellem 2-4% ved hjælp af en flowmeter.</li>
	<li>Sæt musen ind i induktions kammeret og luk den øverste dør. Overvåg musen, indtil den er rekumbøjet. Bemærk: gasserne i kammeret vil holde musene bedøvet i flere minutter.</li>
	<li>Placer musen på en polystyren skum pude indpakket med aluminiumsfolie. Skift strømmen fra induktions kammeret til en nosecone. Sørg for, at anæstesi er tilstrækkelig. Hvis musen er begyndt at reagere, forsigtigt begrænse den i en næse kegle, indtil den er fuldt bedøvet.</li>
	<li>Sørg for anæstesi ved at overvåge respiration og respons på stimulation under proceduren. Justér hastigheds flowmeteret efter behov for at sikre tilstrækkelig anæstesi. Poterne skal være responderende til Pinch Test under anæstesi. Yderligere oplysninger kan fås ved henvendelse til laboratorie vejledningen til pasning af dyr.</li>
	<li>Tape eller PIN ned alle fire lemmer af musen.</li>
	<li>Rengør huden over maven ved at sprøjte med 70% ethanol og tørre den af med gaze og en spritserviet. Dette trin er afgørende for at undgå kontaminering fra musen pels.</li>
	<li>Lav et bredt åbent snit gennem huden fra den forreste til bækken knoglen ved hjælp af et sæt steril saks. Vær omhyggelig med ikke at skære nogen indre organer. Fortrænge tarmene til dyrets venstre side ved hjælp af en bomulds tippet applikator til forsigtigt at udsætte Portal vene (PV) og ringere Vena cava (IVC).</li>
</ol>3. cannulation og perfusion (0,5 h)
<ol><li>Brug buede pincet, Placer en tråd under portalens vene og binde en knudeløst for at forberede bagpå stramt efter kanylering.</li>
	<li>Sæt kanylen (23G fra blodindsamlings sættet) ind i Portal vene 5-10 mm under ligatur. Indsæt ikke kanylen forbi den første Portal gren, ellers kan den højre forreste lap være utilstrækkeligt perfekceret. Kanyle kan fastgøres eller fæstnet med gevind ved hjælp af en prop knude.</li>
	<li>Start pumpen for at tilføre HBU'ERNE en lav strømningshastighed (1-2 mL/min). Når kanylen er bekræftet at være vellykket, leveren vil begynde at Blanch.</li>
	<li>Skær IVC til at lindre trykket og tillade overdreven væske i leveren til at dræne. Dette er bedst udføres ved hjælp af operatørerne anden hånd, så kanylen ikke flyttes.</li>
	<li>Langsomt øge strømningshastigheden til 8 mL/min og fuldføre perfusion ved hjælp af hele 50 mL volumen af HBSS gennem leveren, over de næste 5 min.</li>
	<li>Skift det kollagenase-holdige medium (trin 1,2) ind i bægerglasset, lige før HBU'ERNE begynder at løbe tør. Sørg for, at luftbobler ikke er til stede og ikke strømmer ind i leveren, når mediet skiftes.</li>
	<li>Anvend forbigående tryk til IVC med 5 s intervaller ved at fastspænde med tang. Dette vil få leveren til at svulme og hjælpe med vævs fordøjelse og dissociation (7-8 min). Som fordøjelsen skrider frem, leveren vil svulme og blive hvid. Leveren kan svulme ensartet til omtrent to gange sin oprindelige størrelse.</li>
	<li>Sluk for pumpen og fjern kanylen, når fordøjelsen er fuldført. Færdiggørelsen af lever fordøjelsen vil afhænge af størrelsen af musen og tilstand af leveren. En bule i leveren kan observeres, hvis en bomuld-tippet applikator anvendes til forsigtigt at sonde leveren.</li>
	<li>Fjern galdeblæren fra leveren, at være omhyggelig med ikke at rive den. Ved hjælp af et vasket par saks og pincet, udtrække leveren fra musen til en steril 10 cm kultur skål indeholdende fosfat-bufferet saltvand (PBS) til overflade vask. Overfør leveren omhyggeligt til den sterile 10 cm kultur skål indeholdende kollagenase medium (fra trin 1,8). Dette er et kritisk skridt for at undgå kontaminering fra mus blod og galde.</li>
	<li>Grib og Riv leveren med to rene pincet, mens du forsigtigt ryster cellerne fra leveren. Da dette sker, vil mediet blive overskyet. Alle hepatocytter kan rystes væk, efterlader bindevæv og vaskulære væv.</li>
	<li>At triturere celle opløsningen mange gange ved hjælp af en 3 mL sprøjte, indtil de ufordøjet dele af leveren er rystet af. Hæld det ud i en 50 mL konisk rør med 70 μm nylon celle-strainere til at filtrere eventuelle uforfordøjet bindevæv. Vask skålen med HBSS for at samle de resterende celler og fylde 50 mL konisk slange.</li>
	<li>Centrifuger forsigtigt 50 mL konisk slange i en svingende skovl rotor ved 50 x g i 10 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Supernatanten overføres til et nyt 50 mL konisk rør.</li>
</ol>4. isolering af evt (5 timer)
<ol><li>Supernatanten centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °c. Supernatanten overføres til et nyt 50 mL konisk rør.</li>
	<li>Supernatanten centrifugeres ved 2000 x g i 20 minutter ved 4 °c for at fjerne cellerester og aggregater.</li>
	<li>Supernatanten overføres til et rør med rund bund, og supernatanten centrifugeres ved 10.000 x g i 70 min ved 4 °C.</li>
	<li>Supernatanten opsamles og placeres i en polycarbonat ultracentrifuge tube og centrifugeres ved 100.000 x g i 70 min ved 4 °C.</li>
	<li>Saml pellet i en ultracentrifuge tube, som derefter vaskes ved at re-suspension i PBS. Supernatanten centrifugeres yderligere ved 100.000 x g i 70 min ved 4 °C.</li>
	<li>Den endelige pille, der består af cellulære nanovesikler, kan anvendes direkte til forsøg eller genudsættes med 1000 μL PBS og opbevares ved-80 °C.</li>
</ol>5. vurdering af kvaliteten og udbyttet af isoleringer
<ol><li>Vurder størrelsesfordelingen og koncentrationen ved hjælp af nanopartikel tracking analyse eller tunable resistive puls sensing efter instrument producentens protokoller.</li>
	<li>Udføre yderligere isolering og rensning af specifikke vesikle populationer ved forskellige tilgange såsom tilsætning af en saccharose gradient eller pude, immunoaffinitets teknikker eller størrelses udelukkelse kromatografi, baseret på specifikke eksperimentelle behov.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanovesicle-mediated+microRNA+transfer:+a+mechanism+of+environmental+modulation+of+hepatocellular+cancer+cell+growth.">Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth.</a> Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).</li><li>Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+liver+diseases.">Extracellular vesicles in liver diseases.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).</li><li>Kogure, T., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+nanovesicle+microRNA+from+liver+cancer+cells+in+culture.">Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).</li><li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis;+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14.">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation.">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Currents Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne protokol beskriver en optimal og reproducerbar metode til isolering af hepatisk væv EV ved hjælp af en to-trins perfusions proces via portalen vene efterfulgt af differential ultracentrifugering. Vigtige trin i proceduren omfatter kanyle anbringelse, kollagenase koncentration og fordøjelsestid, flowhastighed af mediet, håndtering af vævet efter fordøjelsen, og klassisk differential ultracentrifugering.
Celleseparation opnås ved adskillelse fra bindevævs komponenter efter fordøjelsen ved hjælp af kollagenase type IV. Koncentrationen af kollagenase, der anvendes til perfusion, kan variere fra 0,1 til 5 mg/mL. Der kan være betydelige batch-til-batch variation i effekten af kollagenase til vævs fordøjelse. Koncentrationerne af kollagenase fra 0,5 til 5 mg/ml blev afprøvet, men den anvendte koncentration havde ikke en væsentlig indvirkning på udbyttet af de opnåede evt. Ved hjælp af en højere koncentration af kollagenase vil resultere i en hurtigere hævelse og blegning af leveren. Målet er at opnå tilfredsstillende celle dissociation uden overdreven kontaminering eller beskadigelse. En optimal koncentration af kollagenase, der anvendes i disse isoleringer er 1-2 mg/ml perfanvendes til 7-8 min ved en strømningshastighed på 8 ml/min. En perfusions procedure, der er for lang, vil øge risikoen for at ødelægge det tynde bindevæv i leveren samt øge de tekniske risici som f. eks.
Det mest udfordrende aspekt ved denne protokol er, at portalen er blevet kanyle. Dette kan være udfordrende at udføre, især i mus i 18-til 25-g-størrelsesintervallet. De teknikker til kollagenase perfusion blev oprindeligt udviklet til brug i rotter og efterfølgende vedtaget til brug i mus efter talrige modifikationer og justeringer. Kanyle behandling ved hjælp af et 23G blodindsamlings sæt er lettere end placeringen af et kateter i blodkar med lille luminale diameter. Fastgørelse af kanyle ved hjælp af tråd med en prop knude anbefales for at undgå frafald og knuden også fungerer som en markør for Portal vene placering i tilfælde af kanyle kommer ud af fartøjet.
For downstream-analyse er det ekstremt vigtigt at have minimal kontaminering fra celler. Der er flere vigtige overvejelser i håndteringen af væv efter fordøjelsen. For det første ændres pincet og saks, når leveren ekstraheres for at undgå blod kontaminering. For det andet er det afgørende, at galdeblæren forsigtigt fjernes fra leveren for at undgå tåreflåd og uønsket kontaminering fra galde. For det tredje, når leveren er blevet fjernet fra musen, leveren vaskes meget forsigtigt ved hjælp af PBS at fjerne ethvert blod. Minimering af kontaminering med celler bør prioriteres højere end reduktionen i udbyttet af de opnåede evt.
Ultracentrifugering er den mest almindeligt anvendte metode til isolering og rensning af EVS8,9,10,11. Denne fremgangsmåde vil fjerne de fleste parentchymal celler såsom hepatocytter eller cholangiocytter og ikke-parentchymale celler såsom Kupffer celler, sinusformet endotelceller, og stellate celler, derudover, celleaffald, celle aggregeringer, og døde celler vil også være fjernes ved differentialcentrifuge ring. Yderligere rensning og isolering af specifikke populationer kan udføres ved størrelses ekskluderings kromatografi for at fjerne eventuelle ikke-vesikulære protein aggregater eller lipoproteiner.
En begrænsning af denne protokol er, at den ikke kan opfange alle vævs vesikler, da nogle vesikler kan fjernes i perfusatet. Hvis der er behov for en samlet vurdering, bør det overvejes at indsamle perfusat og isolere vesikler inden for perfusat. En yderligere begrænsning er potentialet for celleskader. For at overvåge den potentielle virkning af overdreven celledød, kan cellens levedygtighed overvåges og inkorporeres inden for kvalitetsparametre for væv EV isoleringer. Afslutningsvis, denne procedure beskriver en optimeret workflow ved hjælp af en to-trins perfusion teknik via portalen vene efterfulgt af differential ultracentrifugering for at opnå leveren væv EVS fra mus lever ved et højt udbytte. Disse væv EVs er egnede til downstream analyser såsom karakterisering af biomolekyler sammensætning og andre undersøgelser, der har til formål at karakterisere deres fysiologiske eller patofysiologiske roller eller potentielle anvendelser som sygdoms markører.

Ekstracellulære vesikler (EVs) er membranbundne vesikler, der frigives fra mange forskellige typer celler i kroppen. EVs indeholder en last af molekyler, der omfatter RNA, DNA og protein. Overførsel af denne last med EVs fra en celle til en anden er postuleret som en mekanisme, hvormed celler i væv kommunikerer med hinanden1. Størstedelen af oplysningerne om evt-last eller-roller i normale sundheds-og sygdomssygdomme er udledt af undersøgelser af evt opnået fra celler i kultur eller indsamlet fra cirkulation eller andre kropsvæsker2. For at forstå deres fysiologiske roller in vivo, er en robust metode nødvendig for isolering af væv EVS, der fanger alle populationer af EVS og undgår cellulære skader eller forurening3. Det overordnede mål med den metode, der er beskrevet heri, er at isolere vævs-EVs fra muselever.
De fleste celletyper i leveren har vist sig at producere EVs, og studiet af EV-baseret signalering er at fremme grundlæggende viden og forståelse af leversygdomme. Den kombinerede virkning af EVs fra forskellige celletyper i væv er dog kun delvist forstået. Det er nødvendigt at isolere EVs fra levervævet for at forstå in situ -bidragene fra EVS inden for vævs miljøet. Den fremgangsmåde, der er beskrevet heri, er baseret på en to-trins perfusion for at forbedre vævs dissociationen og minimere celle beskadigelse. Efterfølgende er EVs isoleret fra det dissocierede levervæv. Tilgange ved hjælp af to-trins perfusion til isolering af hepatocytter har været anvendt siden begyndelsen af 1950 ' erne4. Disse metoder til hepatocyt isolation er blevet ændret og kontinuerligt forbedret og er nu standard tilgange til isolering af hepatocytter i kulturer, i celle suspensioner, og fra væv5,6,7. I det første trin, leveren er udsat for en ikke-recirkulerende perfusion med calciumfri buffer, Hank's afbalanceret saltopløsning (HBSS). I det andet trin, leveren er perfvant med kollagenase at opløse den ekstracellulære matrix for yderligere adskillelse af desmosomale celle-til-celle vejkryds. En optimal behandlingstid for kollagenase opløsning er 7 til 10 minutter. En kortere behandlingsvarighed vil medføre ufuldstændig opløsning og beholde celle kontakter i leveren, hvorimod en længere varighed kan forårsage leverskader eller Portal vene forstyrrelse. Evt isoleres derefter ved hjælp af differentialcentrifuge ring for at fjerne celler og celleaffald. Dette resulterer i EV-opsamling i høje udbytter, der kan anvendes til yderligere downstream analyser eller undersøgelser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:168px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB500125</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Curved non-serrated scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14069-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Masking tape</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Styrofoam pad</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:168px;">Scientific inc.</td>
			<td>B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Masterflex L/S Digital Miniflex Pump</td>
			<td style="width:168px;">Cole-parmer</td>
			<td>ZX-07525-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Water bath</td>
			<td>Thermo Electron Precision</td>
			<td>2837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:432px;">Blood collection sets</td>
			<td style="width:168px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">367292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:432px;">Petri dish, clear lid 100x15</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 70mm Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Moore medical</td>
			<td>69622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">25mL Serological Pipet</td>
			<td style="width:168px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser</td>
			<td>BioSurplus</td>
			<td>203-2751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:432px;">&#160;Levo Plus Motorized Pipette Filler</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>74020002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5804R</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>22628048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>969347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B34182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JA-25.50Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Round-bottom tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Reagents</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">HyClone Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30588.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase, Type IV, powder</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tissue extracellular vesicles from the liver

Ekstracellulære vesikler (EVs) kan frigives fra mange forskellige celletyper og detekteres i de fleste, hvis ikke alle, kropsvæsker. EVs kan deltage i celle-til-celle-kommunikation ved at fjer de bioaktive molekyler som RNA eller protein fra en celle til en anden. De fleste undersøgelser af evt er udført i cellekultur modeller eller i evt isoleret fra kropsvæsker. Der er voksende interesse for isolering af EVs fra væv for at studere deres bidrag til fysiologiske processer, og hvordan de er ændret i sygdom. Isolering af evt med tilstrækkeligt udbytte fra væv er teknisk udfordrende på grund af behovet for vævs dissociation uden cellulære skader. Denne metode beskriver en procedure for isolering af evt fra muse levervæv. Metoden indebærer en to-trins proces begyndende med in situ kollagenase fordøjelse efterfulgt af differentiel ultra-centrifugering. Vævs perfusion ved hjælp af kollagenase giver en fordel i forhold til mekanisk skæring eller homogenisering af levervæv på grund af dets øgede udbytte af opnået EVS. Brugen af denne to-trins proces til at isolere EVs fra leveren vil være nyttigt for studiet af væv EVs.

Det apparatur, der er nødvendigt for disse isoleringer, består af Standardlaboratorieudstyr, hvilket gør dette til en forholdsvis enkel og omkostningseffektiv metode. Isoleringer er blevet udført fra tolv-til tredive-ugers-gamle mandlige og kvindelige Balb/c eller FVB mus. Bakken holder musen er foret med aluminiumsfolie inde i en hård-walled container, der samler overskydende væsker under perfusion. Kolberne, der indeholder HBSS eller kollagenaseholdigt medium, nedsænkes i et vandbad (40 °C), som er klar til brug. Der anvendes to sterile 10 cm kultur retter. Den ene er nødvendig for overflade vask med PBS, og den anden for hepatocyt adskillelse fra bindevæv komponenter.
I denne metode, leveren er perfanvendes i en ikke-kontinuerlig måde via portalen vene i præference til at kanyle fra ringere Vena cava. En alternativ og almindeligt anvendt perfusion tilgang er at udføre tilbage perfusion ved at cannulere den ringere Vena cava og skære portalen vene til dræning. Men Portal vene kanyle er let at få adgang til og involverer en kort afstand til leveren, som portalen vene feeds direkte ind i leveren8. Udvælgelsen af et indsætningspunkt til kanylering er afgørende for optimal succes (figur 2). Kanylen er placeret forbi grenene af maven og pancreas vener, men ikke ud over den første Portal gren (højre og venstre hepatiske Portal vener). Når den optimale indsættelse placering i portalen vene er identificeret, buede pincet bruges til at placere en tråd nedenunder Portal vene og binde en løs knude. Nålen af kanyle er fastgjort med gevind ved hjælp af en prop knude for at stoppe nålen i at falde ud.
Figur 3 skitserer den samlede forarbejdnings ordning for differentialcentrifuge ring af levervæv EVS-isolation. Ultracentrifugering fjerner celler, snavs og andre urenheder. De første fire Centrifugerings trin (50 x g, 300 x g, 2.000 x g, 10.000 x g) er designet til at fjerne hepatocytter, intakte andre celler, døde celler eller cellerester. (Figur 4a og 4b). Efter disse trin, ultracentrifugering er igen udføres på 100.000 x g at indsamle pellet (figur 4C). Pellet vaskes ved at re-suspendere i PBS og udsættes for en endelig ultracentrifugering på 100.000 x g. Pellet efter ultracentrifugering er helt synlig og viskøs i denne procedure sammenlignet med EVS fra konditioneret kultur medier. Pipettering mange gange er påkrævet, indtil alle brune aggregater er ude af syne og helt opløst. Den endelige pellet er igen suspenderet med 1000 μL PBS (figur 4D). Ultracentrifugering fjerner urenheder og andre opløselige forurenende stoffer fra plasmaet, hvilket kan påvirke funktionelle eksperimentelle resultater. Centrifugerings formen udføres ved 4 °C.
Fra mus lever, denne metode giver en vævs EV koncentration, der spænder fra 1,74 til 4,00 x 1012 med et gennemsnit på 3,46 x 1012 partikler pr. ml som bestemt af nanopartikel tracking analyse (NTA) (figur 5). Den gennemsnitlige størrelse af det isolerede levervæv EVs var 157,7 nm med en tilstands størrelse på 144,5 nm og EV-størrelser fra 100-600 nm til NTA. Udbyttet af EV vil afhænge af faktorer såsom leveren vægt og tab inden for af eller ultracentrifugering trin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig1.jpg"> Figur 1 : Forberedelse af bænken. Materialerne og deres placering er: (A) pumpe, (B) opvarmet 125 mL kolbe indeholdende HBSS og vand sugeport, (C) næse kegle forbundet med en Isoflurane vaporiser, (D) pumpens vand udsugnings havn, der forbinder med nål, (E) bakke foret med aluminiumsfolie inde i en hård behegnet beholder, og (F) 10 cm kulturfad, hvor kollagenase medium hældes på forhånd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig2.jpg"> Figur 2 : Cannulation site. Anatomi af musen maven er vist. Ved hjælp af buede pincet, er en tråd placeret under portalen vene (PV) og en løs knude er bundet. Indsætnings placeringen er tæt på leveren, 5-10 mm under ligatur, men ikke ud over den første Portal gren (venstre og højre hepatisk Portal vener). Kanylen er fikseret eller fastgjort ved hjælp af tråd med en prop knude. Denne knude tjener som markør for PV-lokationen, hvis kanylen er blevet opløst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig3.jpg"> Figur 3 : Skematisk Centrifugerings trin. Målet er at fjerne uønskede celler og andre komponenter og isolere evt. De første fire Centrifugerings trin er designet til at fjerne hepatocytter og andre celler, døde celler eller cellerester ved hjælp af differentiel centrifugering. Efter disse trin, ultracentrifugering udføres på 100.000 x g at indsamle pellet af EVs. Pellet vaskes ved at re-suspendere i PBS og udsættes for en endelig ultracentrifugering på 100.000 x g. Alle Centrifugerings trinene udføres ved 4 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig4.jpg"> Figur 4 : Differentiel centrifugering. A) efter centrifugering ved 50 x g i 10 min. observeres en pellet, der indeholder hepatocytter. B) der anvendes en rund slange til centrifugering ved 10.000 x g i 70 min til fjernelse af cellerester. C) der anvendes en polycarbonat ultracentrifuge tube til centrifugering ved 100.000 x g i 70 min. Pellet opsamles i ét rør og vaskes ved at re-suspension med PBS. D) den endelige pellet suspenderes igen i 1000 μL PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig5.jpg"> Figur 5 : Repræsentativt resultat. Størrelsen og koncentrationen af levervæv EVs kan bestemmes ved nanopartikel tracking analyse (NTA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver at JoVE.com

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Dette er en protokol til at isolere vævs ekstrellulære vesikler (EVs) fra leveren. Protokollen beskriver en to-trins proces, der involverer kollagenase perfusion efterfulgt af differential ultracentrifugering at isolere leveren væv EVS.

Isolering af vævs Ekstrudulære vesikler fra leveren

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Denne metode kan hjælpe os med at løse centrale spørgsmål vedrørende den rolle, ekstracellulære vesikler in vivo, ved at give os en kilde til vesikler, der er repræsentative for det lokale væv mikromiljø. Undersøgelser af ekstracellulære vesikler i vævsmiljøet kan fremme vores forståelse af de fysiologiske roller ekstracellulære vesikler og deres ændringer i patofysiologiske processer in vivo. En visuel demonstration af portalen vene cannulation er nyttigt, da den lille størrelse af venen gør det vanskeligt at vende manipulere.Demonstration af proceduren med Doctor Kaori Ishiguro vil være Irene Yan, en forskning teknolog fra mit laboratorium. Før du begynder proceduren, sikre lemmer af en bedøvet mus og forbinde 23 gauge nål af en bevinget blodtapning indstillet til den frie ende af et stykke sprøjte pumpe slange. Rengør bughulen af musen med 70% ethanol og en alkohol pad og bruge en saks til at åbne musen fra den forreste af brystet til bækkenbenet, passe på ikke at skade nogen indre organer.Brug en bomuld tippet applikator til forsigtigt at flytte tarmene til højre side af bughulen til at udsætte portalen vene og ringere vena cava og bruge buede kraftgrene til at placere en tråd under portalen vene. Bind en knude løst i suturen for at forberede dig til cinching efter kanylen og fyld kanylen med 40 grader Celsius HBSS, indtil opløsningen når kanylenspidsen. Sæt kanylen i portalvenen fem til 10 millimeter under ligaturen og fastgør kanylen med suturen.Start infusionen med en 1-2 milliliter pr. minutstrømningshastighed. Hvis kanylen var korrekt placeret, leveren vil begynde at blanche. Skær ringere vena cava og lad den overdrevne væske i leveren til at dræne.Langsomt øge strømningshastigheden til otte milliliter i minuttet, indtil en fuld 50 milliliter HBSS er blevet perfunderet gennem leveren i løbet af de næste fem minutter. Lige før HBSS løber ud, ændre frisk forberedt 40 grader Celsius kollagen fire opløsning til perfusate bægerglas og bruge kraftkker til at anvende forbigående pres på ringere vena cava på fem sekunders mellemrum at få leveren til at svulme op og hjælpe med væv fordøjelse og dissociation. Som fordøjelsen skrider frem, vil leveren svulme op og blive hvid.Når forbliver deprimeret efter blid sondering med en bomuld tippet applikator, stoppe pumpen og fjerne kanylen. Fjern galdeblæren fra leveren, passe på ikke at rive galdeblæren væv, og bruge rene saks og scef til at høste leveren i en steril 10 centimeter kultur parabol af PBS. Efter skånsom vask, overføre leveren i en ny 10 centimeter kultur fad indeholder frisk kollagen fire opløsning og bruge to rene kraftfæcener til at rive leveren, mens forsigtigt ryster at adskille cellerne fra levervævet.Når hele organet er fragmenteret, skal du bruge en tre millilitersprøjte til at triturere vævsslamenten, indtil de ufordøjede leverstykker rystes af. Hæld den resulterende celleopløsning gennem en 70 mikron nylon mesh si i en 50 milliliter konisk rør, vask skålen med HBSS at indsamle eventuelle resterende celler. Pool vasken med enkelt celle suspension og fjerne hepatocytter ved centrifugering.Overfør derefter supernatanten til et nyt 50 milliliterrør. For at fjerne andre celler skal supernatanten centrifugeres, før den overføres til et nyt konisk rør på 50 milliliter. Fjern de døde celler med en anden centrifugering og overføre supernatant i en rund bund rør til at fjerne eventuelle celle snavs og aggregater.Overfør nu supernatanten til et polycarbonat ultracentrifugerør og opslæm pellet i ca. 20 milliliter PBS i en anden og sidste ultracentrifugering. Derefter opslænves den ekstracellulære nanovesicle pellet i en milliliter PBS for minus 80 grader Celsius opbevaring, hvis vesicles ikke straks vil blive analyseret. Fra en enkelt muselever giver denne metode en ekstracellulær vesiclekoncentration, der varierer fra 1,74 til fire gange 10 til tolvte med et gennemsnit på 3,46 gange 10 til de tolvte partikler pr. milliliter som bestemt ved nanopartikelsporingsanalyse.Gennemsnitsstørrelsen af de isolerede levervæv ekstracellulære vesikler er 157,7 nanometer med en tilstandsstørrelse på 144,5 nanometer og ekstracellulære vesikler størrelser spænder fra 100 til 600 nanometer ved nanopartikel tracking analyse. De ekstracellulære vesikler, der er isoleret ved hjælp af denne fremgangsmåde, er egnede til downstream-anvendelser, og den yderligere karakterisering kan omfatte morfologiske vurderinger ved elektromikroskopi eller analyse af deres overflademarkører eller -indhold.