Denna studie stöddes av finansiering från National Cancer Institute Grant CA-217833.

Alla studier med djur utfördes i enlighet med ett protokoll som godkändes av Mayo Clinic institutionella djuromsorg och användning kommittén.
1. förberedelse av bänk
<ol><li>Förbered ett vattenbad och Ställ in den på 37 ° c. Övrig nödvändig utrustning och apparat visas i figur 1.</li>
	<li>Mät 100 mg kollagenase typ IV och tillsätt den till en 125 mL kolv innehållande 100 mL HBSS i ett vattenbad (40 ° c). Se till att kollagenasen har lösts upp genom att virvlande vätskan i kolven och kontrollera också att kolven är helt nedsänkt i vattenbadet. För ökad effektivitet, låt kollagenase att lösas upp i minst 30 min även om det kan tyckas att upplösas omedelbart.</li>
	<li>Sänk ihop en 125 mL kolv som innehåller 50 mL HBSS i ett vattenbad vid 40 ° c. Detta kommer att användas för inledande spolning.</li>
	<li>Spraya på ytan av alla instrument som saxen och pinps med 70% etanol. Förbered några rena bomullsvabb.</li>
	<li>Skölj ur slangen från pumpen genom att köra 70% etanol genom pumpen och ta bort eventuell kvarvarande etanol genom att skölja den två gånger med rinnande vatten.</li>
	<li>Lägg en absorberande bänk pad på labbet bänken och placera en hård låda behållare ovanpå. Detta kommer att behövas för att innehålla eventuella överskott vätskor under musen perfusion. Linda en polystyren skum pad med aluminiumfolie och placera den inuti behållaren.</li>
	<li>Placera en steril 10 cm kultur rätt nära bänken. Detta kommer att användas för att hålla smält levern efter perfusion är avslutad.</li>
	<li>Häll 10 mL kollagenasmedium (steg 1,2) i en steril kultur rätt i förväg.</li>
	<li>Med hjälp av en bevingad blod samling uppsättning, Anslut 23-gauge till den fria änden av pumpen slangen (skära vingarna från fjärilkanyl kan leda till bättre hantering). Passera tills spetsen av kanyl blod samling fylls.</li>
</ol>2. djur beredning
<ol><li>Innan du påbörjar anestesi med isofluran, se till att en tillräcklig mängd av tillförselen gas är tillgänglig för varaktigheten av förfarandet. Slå på syretillförseln (O2) till induktions kammaren vid 1-2 L och slå sedan på isofluran mellan 2-4% med hjälp av en flödesmätare.</li>
	<li>Placera musen i induktions kammaren och Stäng den övre luckan. Övervaka musen tills den är recumbent. Obs: gaserna i kammaren kommer att hålla mössen sövda i flera minuter.</li>
	<li>Placera musen på en polystyren skum pad insvept med aluminiumfolie. Byt flödet från induktions kammaren till en Nosecone. Se till att anestesi är adekvat. Om musen har börjat svara, försiktigt hålla den i en näskon tills den är helt sövda.</li>
	<li>Säkerställ anestesi genom att övervaka andning och respons på stimulering under ingreppet. Justera hastigheten flödesmätaren som behövs för att säkerställa adekvat anestesi. Tassar måste vara inte svarar till nypa testet under anestesi. Ytterligare detaljer kan erhållas från laboratorie guiden för skötsel av djur.</li>
	<li>Tejpa eller Fäst alla fyra extremiteterna i musen.</li>
	<li>Rengör huden över buken genom att spraya med 70% etanol och torka av den med gasväv och en alkoholdyna. Detta steg är avgörande för att undvika kontaminering från mus päls.</li>
	<li>Gör ett vidöppet snitt genom huden från den främre till bäckenet benet med en uppsättning av steril sax. Var noga med att inte skära några inre organ. Förflytta tarmen till djurets vänstra sida med hjälp av en bomulls tippad applikator för att försiktigt exponera portalen ven (PV) och sämre Vena Cava (IVC).</li>
</ol>3. kanylering och perfusion (0,5 h)
<ol><li>Med böjda tång, placera en tråd under portalen ven och knyta en Knut löst för att förbereda Dubbelfästande tätt efter kanylering.</li>
	<li>Sätt in kanyl (23G från blod samlings uppsättningen) i Portal venen 5-10 mm under ligatur. Sätt inte in kanyl förbi den första portalen gren, annars rätt främre LOB kan vara otillräckligt parfymera. Kanylen kan fästas eller fästas med tråden genom att använda en propp Knut.</li>
	<li>Starta pumpen för att ingjuta i HBSS vid ett lågt flöde (1-2 mL/min). När kanylering bekräftas att vara framgångsrik, levern börjar blanchera.</li>
	<li>Skär IVC att lindra trycket och tillåta överdriven vätska i levern att dränera. Detta utförs bäst med hjälp av operatörerna andra handen så kanyla inte flyttas.</li>
	<li>Öka långsamt flödet till 8 mL/min och slutföra perfusion med hela 50 mL volym av HBSS genom levern, under de kommande 5 min.</li>
	<li>Ändra kollagenase innehållande medium (steg 1,2) in i bägaren strax innan HBSS börjar ta. Se till att luftbubblor inte är närvarande och inte rinner in i levern när du byter medium.</li>
	<li>Applicera övergående tryck på IVC vid 5 s intervaller genom att klämma fast med pincett. Detta kommer att orsaka levern att svälla och hjälpa till med vävnad nedbrytning och dissociation (7-8 min). Som matsmältningen fortskrider, levern kommer att svälla och bli vit. Levern kan svälla jämnt till ungefärligt dubbelt dess original storleksanpassar.</li>
	<li>Stäng av pumpen och ta bort kanylen när matsmältningen är klar. Slutförandet av levern matsmältningen kommer att bero på storleken på musen och tillstånd i levern. En buckla i levern kan observeras om en bomullstippad applikator används för att försiktigt sond levern.</li>
	<li>Ta bort gallblåsan från levern, är noga med att inte riva den. Med hjälp av en tvättad sax och pinpett, extrahera levern från musen till en steril 10 cm kultur maträtt som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för yttvätt. Överför levern noggrant till den sterila 10 cm kultur skålen som innehåller kollagenasmedium (från steg 1,8). Detta är ett kritiskt steg för att undvika kontaminering från mus blod och galla.</li>
	<li>Greppa och riva isär levern med två rena pinproppar samtidigt försiktigt skaka cellerna från levern. Eftersom detta händer, mediet kommer att bli grumlad. Alla hepatocyter kan skakas bort, lämnar bakom bindväv och vaskulär vävnad.</li>
	<li>Triturera cell lösningen många gånger med en 3 mL spruta tills de osmälta delarna av levern är skakade. Häll av den i en 50 mL koniskt rör med 70 μm nylon cell silar för att filtrera osmält bindväv. Tvätta skålen med HBSS för att samla de återstående cellerna och fylla upp 50 mL koniska röret.</li>
	<li>Centrifugera mjukt 50 mL koniskt rör i en svängig skopa rotor vid 50 x g i 10 min vid 4 ° c.</li>
	<li>Överför supernatanten till ett nytt 50 mL koniskt rör.</li>
</ol>4. isolering av EVs (5 h)
<ol><li>Centrifugera supernatanten vid 300 x g i 10 min vid 4 ° c. Överför supernatanten till ett nytt 50 mL koniskt rör.</li>
	<li>Centrifugera supernatanten vid 2000 x g i 20 min vid 4 ° c för att ta bort Cellrester och aggregat.</li>
	<li>Överför supernatanten till ett runt botten rör och Centrifugera supernatanten på 10 000 x g för 70 min vid 4 ° c.</li>
	<li>Samla supernatanten och placera i en polykarbonat första röret och centrifugera vid 100 000 x g för 70 min vid 4 ° c.</li>
	<li>Samla upp pelleten i ett första-rör som sedan tvättas genom att Återsuspendera i PBS. Centrifugera supernatanten ytterligare vid 100 000 x g för 70 min vid 4 ° c.</li>
	<li>Den slutliga pelleten bestående av cellulära nanovesikler kan användas direkt för experiment eller återsuspenderas med 1000 μL PBS och lagras vid-80 ° c.</li>
</ol>5. bedömning av isolations kvalitet och avkastning
<ol><li>Bedöma storleksfördelning och koncentration med hjälp av analys av nanopartikel-spårning eller avstämbar resistiv puls avkänning enligt instrumenttillverkarens protokoll.</li>
	<li>Utföra ytterligare isolering och rening av specifika vesikler populationer genom olika metoder såsom tillsats av en sackaros gradient eller kudde, immunoaffinity tekniker, eller storlek uteslutning kromatografi, baserat på specifika experimentella behov.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanovesicle-mediated+microRNA+transfer:+a+mechanism+of+environmental+modulation+of+hepatocellular+cancer+cell+growth.">Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth.</a> Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).</li><li>Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+liver+diseases.">Extracellular vesicles in liver diseases.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).</li><li>Kogure, T., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+nanovesicle+microRNA+from+liver+cancer+cells+in+culture.">Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).</li><li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis;+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14.">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation.">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Currents Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Detta protokoll beskriver en optimal och reproducerbar metod för isolering av levervävnad EV med hjälp av en två-stegs perfusion process via portalen ven följt av differentiell ultracentrifugation. Viktiga steg i förfarandet inkluderar kanyl placering, kollagenas koncentration och digestionstid, flödeshastighet av mediet, hantering av vävnaden efter matsmältningen, och klassisk differential ultracentrifugation.
Cell separation uppnås genom separation från bindvävs komponenter efter nedbrytning med kollagenas typ IV. Koncentrationen av kollagenas som används för perfusion kan variera från 0,1 till 5 mg/mL. Det kan finnas betydande sats-till-sats variation i effekten av kollagenase för vävnadsnedbrytning. Koncentrationerna av kollagenas från 0,5 till 5 mg/mL testades, men den koncentration som användes hade inte någon större inverkan på avkastningen av erhållna EVs. Med hjälp av en högre koncentration av kollagenase kommer att resultera i en snabbare svullnad och blekning av levern. Målet är att uppnå tillfredsställande cell dissociation utan överdriven kontaminering eller skador. En optimal koncentration av kollagenas som används i dessa isoleringar är 1-2 mg/ml perfunderade för 7-8 min med en flödeshastighet på 8 ml/min. En perfusion förfarande som är för lång kommer att öka risken för att förstöra den tunna bindväv i levern samt öka tekniska risker såsom nål dislodgment från portalen ven eller luft svällning med venen.
Den mest utmanande aspekten av detta protokoll är kanyleringen av portalen ven. Detta kan vara utmanande att utföra, särskilt i möss i 18-till 25-g storleksintervall. Teknikerna för kollagenas perfusion utvecklades ursprungligen för användning hos råttor och antogs därefter för användning på möss efter många modifieringar och justeringar. Kanylering med hjälp av en 23G blod samling set är lättare än placeringen av en kateter i blodkärlen i liten luminala diameter. Fastställande av kanyl med hjälp av tråd med en propp Knut rekommenderas för att undvika fördrivning och knuten fungerar också som en markör för portalen ven plats i fall kanyl lossnar fartyget.
För nedströms analys är det oerhört viktigt att ha minimal kontaminering från celler. Det finns flera viktiga överväganden i hanteringen av vävnad efter matsmältningen. Först, pinkoppar och sax ändras när levern extraheras för att undvika blod förorening. För det andra är det viktigt att gallblåsan försiktigt avlägsnas från levern för att undvika att riva och oönskad kontaminering från galla. Tredje, när levern har tagits bort från musen, levern tvättas mycket försiktigt med PBS att ta bort blod. Minimering av kontaminering med celler bör ges högre prioritet än minskning av avkastningen för erhållna EVs.
Ultracentrifugation är den mest använda metoden för isolering och rening av EVS8,9,10,11. Denna metod kommer att ta bort de flesta parenkymala celler såsom hepatocyter eller cholangiocyter och icke-parenkymala celler såsom Kupffer celler, sinusformade endotelceller, och stellate celler, dessutom kommer cellfragment, cell aggregeringar och döda celler också att avlägsnas genom differential centrifugering. Ytterligare rening och isolering av specifika populationer kan utföras av storleks uteslutnings kromatografi för att avlägsna alla icke-vesikulär protein aggregat eller lipoproteiner.
En begränsning av detta protokoll är att den inte kan fånga alla vävnads blåsor, med tanke på möjligheten att vissa blåsor kan avlägsnas i parfymen. Om en helhetsbedömning behövs, bör insamling av parfymen och isolering av vesikler inom parfymen övervägas. En ytterligare begränsning är potentialen för cellskador. För att övervaka den potentiella effekten av överdriven celldöd, kan cellernas lönsamhet övervakas och införlivas i kvalitetsparametrar för vävnads-EV-isoleringar. Sammanfattningsvis beskriver detta förfarande ett optimerat arbetsflöde med hjälp av en två-stegs perfusion teknik via portalen ven följt av differentiell ultracentrifugering för att få levervävnad EVS från mus lever vid en hög avkastning. Dessa vävnad EVs är lämpliga för nedströms analyser såsom karakterisering av Biomolekylär sammansättning och andra studier som syftar till att karakterisera deras fysiologiska eller patofysiologiska roller eller potentiella tillämpningar som sjukdomsmarkörer.

Extracellulära blåsor (EVs) är membran-bundna blåsor som frigörs från många olika typer av celler i kroppen. EVs innehåller en last av molekyler som inkluderar RNA, DNA, och protein. Överföring av denna last av EVS från en cell till en annan är postulerade som en mekanism genom vilken celler i vävnader kommunicerar med varandra1. Merparten av information om lasten eller rollerna av EVs vid normal hälsa och sjukdom har hämtats från studier av EVs som erhållits från celler i kultur eller samlats in från cirkulationen eller andra kroppsvätskor2. För att förstå deras fysiologiska roller in vivoär en robust metod nödvändig för isolering av vävnadevs som fångar alla populationer av EVS och undviker cellulära skador eller kontaminering3. Det övergripande målet för den metod som beskrivs häri är att isolera vävnad EVs från mus lever.
De flesta celltyper i levern har visat sig producera EVs, och studiet av EV-baserade signalering är att främja grundläggande kunskap och förståelse för leversjukdomar. Den kombinerade effekten av EVs från olika celltyper inom vävnader är dock endast delvis förstådd. Isolering av EVs från levervävnad är nödvändig för att förstå in situ -bidragen från EVS inom vävnads miljön. Den metod som beskrivs häri är baserad på en två-stegs perfusion för att förbättra vävnads dissociation och minimera cellskador. Därefter isoleras EVs från den separerade lever vävnaden. Metoder med två-stegs perfusion för isolering av hepatocyter har använts sedan början av 1950-talet4. Dessa metoder för hepatocyte isolering har modifierats och kontinuerligt förbättrats och är nu standardmetoder för isolering av hepatocyter i kulturer, i cellsuspensioner, och från vävnader5,6,7. I det första steget, levern utsätts för en icke-recirkulerande perfusion med kalcium-fri buffert, Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS). I det andra steget, levern är parfymerad med kollagenase att lösa upp den extracellulära matrisen för ytterligare separation av desmosomal cell-till-cell korsningar. En optimal behandlingstid för upplösning av kollagenase är 7 till 10 minuter. En kortare behandlingstid kommer att orsaka ofullständig upplösning och behålla Cellkontakter i levern, medan en längre varaktighet kan orsaka leverskador eller Portal ven störningar. EVs isoleras sedan med differentialcentrifugering för att avlägsna celler och cellulär skräp. Detta resulterar i EV insamling i hög avkastning som kan användas för ytterligare nedströms analyser eller studier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:168px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB500125</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Curved non-serrated scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14069-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Masking tape</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Styrofoam pad</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:168px;">Scientific inc.</td>
			<td>B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Masterflex L/S Digital Miniflex Pump</td>
			<td style="width:168px;">Cole-parmer</td>
			<td>ZX-07525-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Water bath</td>
			<td>Thermo Electron Precision</td>
			<td>2837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:432px;">Blood collection sets</td>
			<td style="width:168px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">367292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:432px;">Petri dish, clear lid 100x15</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 70mm Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Moore medical</td>
			<td>69622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">25mL Serological Pipet</td>
			<td style="width:168px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser</td>
			<td>BioSurplus</td>
			<td>203-2751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:432px;">&#160;Levo Plus Motorized Pipette Filler</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>74020002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5804R</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>22628048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>969347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B34182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JA-25.50Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Round-bottom tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Reagents</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">HyClone Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30588.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase, Type IV, powder</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tissue extracellular vesicles from the liver

Extracellulära blåsor (EVs) kan släppas från många olika celltyper och detekteras i de flesta, om inte alla, kroppsvätskor. EVs kan delta i cell-till-cellkommunikation genom shuttling bioaktiva molekyler såsom RNA eller protein från en cell till en annan. De flesta studier av EVs har utförts i cellkultur modeller eller i EVs isolerade från kroppsvätskor. Det finns ett växande intresse för isolering av EVs från vävnader för att studera deras bidrag till fysiologiska processer och hur de förändras i sjukdom. Isoleringen av EVs med tillräcklig avkastning från vävnader är tekniskt utmanande på grund av behovet av vävnads dissociation utan cellulära skador. Denna metod beskriver ett förfarande för isolering av EVs från mus levervävnad. Metoden omfattar en tvåstegsprocess som inleds med in situ -kollagenasnedbrytning följt av differential Ultra-centrifugering. Vävnad perfusion med hjälp av kollagenase ger en fördel framför mekanisk skärning eller homogenisering av levervävnad på grund av dess ökade avkastningen av erhållna EVs. Användningen av denna tvåstegsprocess för att isolera EVs från levern kommer att vara användbart för studier av vävnad EVs.

Den apparat som behövs för dessa isoleringar består av standard laboratorieutrustning, vilket gör detta till en relativt enkel och kostnadseffektiv metod. Isoleringar har utförts från tolv till trettio veckor gamla manliga och kvinnliga Balb/c eller FVB möss. Facket håller musen är fodrad med aluminiumfolie inuti en hårdväggiga behållare som samlar överflödig vätska under perfusion. Kolvar som innehåller HBSS-eller kollagenasinnehållande medium är nedsänkt i ett vattenbad (40 ° c) som är färdigt att användas. Två sterila 10 cm kultur rätter används. En behövs för yttvätt med PBS, och den andra för hepatocyte separation från bindväv komponenterna.
I denna metod, levern är parfymera på ett icke-kontinuerligt sätt via portalen ven i stället för kanylering från sämre Vena Cava. En alternativ och vanligt förekommande perfusion tillvägagångssätt är att utföra retrograd perfusion genom kanylering sämre Vena Cava och skära portalen ven för dränering. Emellertid, Portal Vein kanylering är lätt att komma åt och innebär en kort sträcka till levern, som portalen ven matar direkt in i levern8. Valet av en insättningspunkt för kanylering är avgörande för optimal framgång (figur 2). Den kanyl placeras förbi grenarna av magen och bukspottskörteln vener men inte bortom den första portalen gren (höger och vänster lever Portal vener). När den optimala insättnings platsen i portalen ven identifieras, böjda pinpett används för att placera en tråd under portalen ven och knyta en lös knut. Nålen av kanyl är fast med tråd med hjälp av en propp Knut för att stoppa nålen från att falla ut.
Figur 3 beskriver det övergripande behandlingssystemet för differential centrifugering för isolering av levervävnad EVS. Ultracentrifugation avlägsnar celler, skräp och andra orenheter. De första fyra centrifugeringsstegen (50 x g, 300 x g, 2 000 x g, 10 000 x g) är utformade för att avlägsna hepatocyter, intakt andra celler, döda celler, eller cell skräp respektive. (Figurerna 4a och 4b). Efter dessa steg utförs ultracentrifugering igen på 100 000 x g för att samla upp pelleten (figur 4C). Pelleten tvättas genom åter uppehåll i PBS och utsätts för en slutlig ultracentrifugering vid 100 000 x g. Pelleten efter ultracentrifugering är absolut synlig och klibbig i detta förfarande jämfört med EVS från konditionerade kulturmedia. Pipettering krävs många gånger tills alla bruna aggregat är utom synhåll och helt upplöst. Den slutliga pelleten återsuspenderas med 1000 μL PBS (figur 4D). Ultracentrifugation avlägsnar orenheter och andra lösliga föroreningar från plasman, vilket kan påverka funktionella experimentella resultat. Centrifugeringen skall utföras vid 4 ° c.
Från mus lever, denna metod ger en vävnad EV koncentration som sträcker sig från 1,74 till 4,00 x 1012 med ett medelvärde av 3,46 x 1012 partiklar per ml som bestäms av nanopartiklar spårningsanalys (NTA) (figur 5). Den genomsnittliga storleken på den isolerade levervävnad EVs var 157,7 nm, med en läges storlek på 144,5 nm och EV storlekar från 100-600 Nm med NTA. Avkastningen av EV kommer att bero på faktorer som levervikt och förluster inom vätska eller ultracentrifugering steg.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig1.jpg"> Figur 1 : Bänk beredning. Materialen och deras placering är: (A) pump, (B) värmd 125 mL kolv innehållande HBSS och vatten sug port, (C) näsa kon ansluten till en isofluran förgasare, (D) vatten avgas port av pumpen ansluter med nål, (E) bricka fodrad med aluminiumfolie inuti en hård muromgärdad behållare och (F) 10 cm odlings fat där kollagenasmediet hälls i förväg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig2.jpg"> Figur 2 : Cannulation plats. Musens anatomi visas. Med böjda tång, är en tråd placerad under portalen ven (PV) och en lös knut är knuten. Insättnings platsen är nära levern, 5-10 mm under ligatur, men inte bortom den första portal grenen (vänster och höger lever Portal vener). Kanylaen fixas eller fästas genom att använda tråden med en propp Knut. Denna Knut fungerar som en markör för PV plats om kanyla är disinges. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig3.jpg"> Figur 3 : Schematisk centrifugering steg. Målet är att ta bort oönskade celler och andra komponenter och isolera EVs. De första fyra centrifugeringsstegen är utformade för att avlägsna hepatocyter och andra celler, döda celler eller cellfragment med differentiell centrifugering. Efter dessa steg, ultracentrifugering utförs på 100 000 x g att samla in pelleten av EVS. Pelleten tvättas genom åter uppehåll i PBS och utsätts för en slutlig ultracentrifugering vid 100 000 x g. Alla centrifugeringssteg utförs vid 4 ° c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig4.jpg"> Figur 4 : Differentiell centrifugering. A efter centrifugering vid 50 x g under 10 min observeras en pellet som innehåller hepatocyter. (B) ett rund botten rör används för centrifugering vid 10 000 x g för 70 min för att avlägsna Cellrester. C en polykarbonat första rör används för centrifugering vid 100 000 x g för 70 min. Pelleten samlas i ett rör och tvättas genom åter uppehåll med PBS. D) den slutliga pelleten återsuspenderas i 1000 μL PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig5.jpg"> Figur 5 : Representativt resultat. Storleken och koncentrationen av levervävnad EVS kan bestämmas genom nanopartiklar spårningsanalys (NTA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver at JoVE.com

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Detta är ett protokoll för att isolera vävnad extracellulära vesikler (EVs) från levern. Protokollet beskriver en tvåstegsprocess som inbegriper kollagenasper fusion följt av differential ultracentrifugering för att isolera levervävnad EVS.

Isolering av vävnads extracellulära blåsor från levern

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Denna metod kan hjälpa oss att ta itu med viktiga frågor när det gäller rollen av extracellulära vesiklar in vivo, genom att ge oss en källa av vesiklar som är representativa för den lokala vävnaden mikromiljö. Studier av extracellulära vesicles inom vävnaden miljön kan ytterligare vår förståelse av de fysiologiska roller extracellulära vesicles och deras förändringar i patofysiologiska processer in vivo. En visuell demonstration av portalvenen kannulation är till hjälp som den lilla storleken på venen gör det svårt att vända manipulera.Demonstrerar proceduren med doktor Kaori Ishiguro blir Irene Yan, forskningstekniker från mitt labb. Innan du börjar proceduren, säkra lemmarna på en sövd mus och anslut 23 gauge nålen av en bevingad blodsamling inställd på den fria änden av en bit spruta pumprör. Rengör buken huden på musen med 70%etanol och en alkohol pad och använda sax för att öppna musen från främre delen av bröstet till bäckenbenet, var noga med att inte skada några inre organ.Använd en bomull tippas applikator för att försiktigt flytta tarmarna till höger sida av bukhålan för att exponera portalvenen och sämre vena cava och använda böjda tlys för att placera en tråd under portalvenen. Knyt en knut löst i suturen för att förbereda för cinching efter kanyleringen och fyll kanylen med 40 grader Celsius HBSS tills lösningen når kanylnålsspetsen. Sätt in kanylen i portalvenen fem till 10 millimeter under ligaturen och säkra kanylen med suturen.Starta infusionen med en en till två milliliter per minut flödeshastighet. Om kanylen var korrekt placerad, kommer levern att börja blanche. Skär den underlägsna vena cava och låt den överdrivna vätskan i levern att rinna.Långsamt öka flödet till åtta milliliter per minut tills hela 50 milliliter HBSS har perfused genom levern under de kommande fem minuterna. Strax innan HBSS tar, ändra nyberedda 40 grader Celsius kollagenas fyra lösning på perfusate bägaren och använda tövröpningar för att tillämpa övergående tryck på sämre vena cava med fem sekunders mellanrum för att orsaka levern att svälla och för att hjälpa till med vävnad matsmältning och dissociation. Som matsmältningen fortskrider, levern kommer att svälla och bli vit.När förblir nedtryckt efter skonsam sondering med en bomullstippad applikator, stanna pumpen och ta bort kanylen. Ta bort gallblåsan från levern, var noga med att inte riva gallblåsan vävnaden, och använda rena sax och tivor för att skörda levern i en steril 10 centimeter kultur maträtt av PBS. Efter skonsam tvätt, överför levern till en ny 10 centimeter kultur maträtt som innehåller färska kollagenas fyra lösning och använda två rena tövär för att riva levern samtidigt försiktigt skakar för att skilja cellerna från levervävnaden.När hela organet har fragmenterat, använd en tre milliliter spruta för att triturtera vävnadsslammen tills de osmälta bitar av levern skakas av. Häll den resulterande celllösningen genom en 70 mikron nylon mesh sil i en 50 milliliter koniska röret, tvätta skålen med HBSS för att samla eventuella återstående celler. Poola tvätten med engångscellsupphängningen och avlägsna hepatocyterna genom centrifugeringen.Överför sedan supernatanten till ett nytt 50 milliliterrör. För att avlägsna eventuella andra celler, centrifuger supernatanten före överföring till ett nytt koniskt rör på 50 milliliter. Ta bort de döda cellerna med en annan centrifugering och överför supernatanten i ett runt bottenrör för att ta bort eventuellt cellskräp och aggregat.Överför nu supernatanten till ett polykarbonat ultracentrifugeringsrör och återanvänd pelleten i ca 20 milliliter PBS för en andra och sista ultracentrifugering. Sedan resuspend den extracellulära nanovesikel pellet i en milliliter av PBS för minus 80 grader Celsius lagring om vesiklarna inte kommer att omedelbart analyseras. Från en enda muslever ger denna metod en vävnad extracellulär vesikelkoncentration som sträcker sig från 1,74 till fyra gånger 10 till tolfte med ett medelvärde på 3,46 gånger 10 till tolfte partiklar per milliliter som bestäms av nanopartikelspårningsanalys.Medelstorleken på den isolerade levervävnad extracellulära vesiklar är 157,7 nanometer med ett läge storlek 144,5 nanometer och extracellulära vesiklar storlekar från 100 till 600 nanometer genom nanopartikel spårning analys. De extracellulära vesiklar som isoleras med hjälp av detta tillvägagångssätt är lämpliga för tillämpningar nedströms och den ytterligare karakteriseringen kan omfatta morfologiska bedömningar genom elektromikroskopi eller analys av deras ytmarkörer eller innehåll.