Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)

Einzelne Zelle RNA Sequenzierung (RNA-Seq) ist jetzt ein weit implementierten Werkzeug für die Untersuchung der Genexpression. Handelsübliche einzellige RNA-Sequenzierung Plattformen verarbeiten alle Eingabezellen wahllos. Manchmal wird Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) stromaufwärts verwendet, um einen speziell gekennzeichneten Bevölkerung von Interesse zu isolieren. Eine Einschränkung des FACS ist die Notwendigkeit für eine hohe Anzahl von Eingabezellen mit deutlich beschrifteten Brüche, unpraktisch zum sammeln und Profilerstellung seltene oder spärlich beschrifteten Neuron Populationen aus dem Gehirn der Maus. Hier beschreiben wir eine Methode für manuell sammeln spärlich Eindringmittel mit der Bezeichnung einzelner Neuronen aus frisch Maus Hirngewebe dissoziiert. Dieser Prozess ermöglicht es für die Erfassung mit der Bezeichnung der einzelnen Neuronen mit hoher Reinheit und anschließende Integration mit einer in-vitro- Transkription-basierte Verstärkung Protokoll, die endogene Transkript Verhältnisse bewahrt. Wir beschreiben eine doppelte lineare Verstärkung-Methode, die einzigartige Molekül Bezeichner (UMIs) verwendet, um einzelne mRNA zählt zu generieren. Zwei Runden der Verstärkung ergibt ein hohes Maß an gen-Erkennung pro Einzelzelle.